細胞外囊泡（EVs）是細胞釋放的納米級脂質雙層結構，攜帶蛋白質、核酸等生物分子，在細胞間通訊和疾病發展中起關鍵作用。然而，傳統方法難以同時分析EVs的內外蛋白。2022年發表在《ACS Sensors》的研究提出了一種名為EVPIo的高通量多重分析技術，結合抗體微陣列和信號放大策略，成功實現了EVs內外蛋白的同步檢測。該研究中， InnoScan 1100 AL 共聚焦微陣列掃描儀作為核心檢測設備，為實驗數據的獲取提供了重要支持。
 
技術原理與工作流程

EVPio技術的核心分為三個步驟： 1. 抗體微陣列捕獲EVs：通過噴墨打印技術在醛基化玻片上制備16個抗體微陣列，每個陣列包含10×10的抗體斑點（圖1A,1B），靶向EVs表面蛋白（如EpCAM、CD9等）。
  圖1:A, B
2. 抗原修復（AR ）與透化處理：優化后的AR條件（90°C PBS處理1分鐘）打破了EVs內部蛋白的交叉連接，使其能被抗體識別（圖2A）。實驗數據顯示，AR處理后HSP90（內蛋白）信號提升至51,000 RFU，而EGFR（外蛋白）信號保持相對穩定。  
  圖2: A  
3. 多重檢測與信號放大：采用寡核苷酸條形碼標記的檢測抗體和分支DNA擴增技術（圖3，A，B, C）。其中，雙分支DNA樹（4個熒光基團）的信噪比（SNR）與傳統的生物素-鏈霉親和素法相當（圖3D）。   圖3.  
InnoScan 的作用：該掃描儀用于熒光信號的定量采集，通過多通道成像（如Alexa Fluor 488、Cy5等）解析不同蛋白的表達水平。HT29 EVs通過InnoScan三色熒光信號（Alexa Fluor 647、Cy3、Alexa Fluor 488nn）同步檢測HSP70、CD9和CD63。
 
關鍵數據與發現
研究以結直腸癌細胞（HT29和SW403）的EVs為模型，通過四種表面蛋白（EpCAM、CD9、CD63、CD81）捕獲EVs, 并檢測12種內外蛋白的共表達模式（圖5）。
 
    圖5. 對四種捕獲抗體和陰性對照（GFP）所結合的HT29與SW403細胞外囊泡（濃度1.8×101?顆粒/毫升）進行多重EVPio分析，通過四個獨立的三重檢測同時分析12種內外蛋白。(A)HT29與(B)SW403囊泡的表型分型結果。SW403的數據以SW403與HT29信號比值呈現，突出兩細胞系囊泡差異。內部蛋白標為紅色強調。HT29囊泡中CD9?亞群總體信號最強，其中ITG α6、CD63、ITG β1和ITG β4為顯著檢出標志物，HSP70與Alix是最強內部靶點。SW403囊泡的EpCAM?亞群中ITG α6、CD9和CD81信號顯著更高。灰色數值表示未檢測到信號。  
技術優勢與局限性
EVPio 技術優勢：
1.高通量：單張玻片可分析16個樣本，12個指標檢測。
2.靈敏度：分支DNA擴增提升了低豐度內蛋白的檢出限。
3.靈活性：寡核苷酸條形碼避免了抗體物種限制。 局限性：AR處理會降低外蛋白信號，需通進一步實驗優化。此外，Cy3通道易受背景干擾，建議改用近紅外熒光基團。
 
總結與展望
EVPio技術通過整合抗體微陣列、InnoScan掃描儀和分支DNA擴增，為EVs蛋白組學研究提供了新工具。未來可應用于臨床樣本分析，例如通過EVs蛋白特征鑒定癌癥亞型。研究者計劃進一步優化抗原修復條件，并探索與測序技術的聯用，以提升多重檢測能力。
 
文獻原文鏈接： https://doi.org/10.1021/acssensors.2c01750