一、犬松弛素（CHW）概述

犬松弛素（Canine Relaxin，CHW）是由犬卵巢、胎盤等組織分泌的肽類激素，屬于胰島素超家族。其主要功能包括：

• 妊娠期松弛骨盆韌帶、軟化子宮頸，促進分娩；
• 參與心血管調節、乳腺發育及組織修復等生理過程。
  制備 CHW 單克隆抗體對犬繁殖疾病診斷（如早產、流產檢測）、生殖內分泌研究及相關藥物開發具有重要意義。

二、CHW 單克隆抗體制備流程
（一）抗原制備與優化

1. CHW 蛋白獲取

   • 天然提取：從妊娠犬胎盤或卵巢組織中通過勻漿、離心提取粗蛋白，再經層析（親和層析 / 離子交換層析）純化，但天然蛋白產量低、純度難以保證。
   • 重組表達： 
     • 克隆犬松弛素基因（含 A 鏈和 B 鏈編碼區），構建至原核表達載體（如 pET 系統）或真核載體（如 CHO 細胞）；
     • 誘導表達后，通過鎳柱親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE 和 Western blot 驗證純度（≥95%），并復性處理以確?？乖瓨嬒笳_。

2. 抗原修飾與佐劑結合

   • 由于 CHW 分子量小（約 6 kDa），需與載體蛋白（如 KLH、BSA）偶聯以增強免疫原性；
   • 與弗氏完全佐劑（初次免疫）或不完全佐劑（加強免疫）按 1:1 體積比乳化，制備免疫抗原。

（二）動物免疫方案

1. 實驗動物選擇
   6-8 周齡 SPF 級 Balb/c 小鼠（n=3-5），免疫前檢測血清背景抗體（避免非特異性反應）。

2. 免疫程序

   • 初次免疫：背部皮下多點注射偶聯抗原（50-100 μg / 只）+ 弗氏完全佐劑；
   • 加強免疫：每 2-3 周注射一次，共 3-4 次，使用弗氏不完全佐劑，劑量同初次；
   • 末次免疫：融合前 3 天，腹腔注射無佐劑抗原（50 μg / 只），刺激 B 細胞活化。

3. 免疫效果監測
   末次免疫后 7 天，采集小鼠血清，用 ELISA 法檢測抗 CHW 抗體效價，選擇效價≥1:10,000 的小鼠進行脾細胞提取。

（三）雜交瘤細胞制備與篩選

1. 脾細胞與骨髓瘤細胞融合

   • 取免疫小鼠脾臟，制備單細胞懸液（約 1×10^8 個細胞），與對數生長期的 SP2/0 骨髓瘤細胞（脾細胞：骨髓瘤細胞 = 5:1）在 50% PEG（分子量 1500）作用下，37℃融合 1.5 分鐘，隨后用 HAT 培養基終止反應。

2. HAT 培養基篩選
   接種融合細胞于 96 孔板（2×10^5 細胞 / 孔），培養 4-5 天后，未融合細胞死亡，僅雜交瘤細胞存活（需每日觀察細胞狀態，更換 1/2 培養基）。

3. 陽性克隆篩選與克隆化

   • ELISA 初篩：以重組 CHW 蛋白包被 96 孔板（1 μg/mL），加入培養上清，篩選 OD 值≥陰性對照 2.1 倍的孔；
   • 有限稀釋法克隆化：將陽性孔細胞按 0.5 個 / 孔接種至 96 孔板，重復 3 次克隆化，直至獲得單克隆細胞株（確保單克隆抗體特異性）。

（四）單克隆抗體生產與純化

1. 腹水制備（大量生產）

   • 給 Balb/c 小鼠腹腔注射石蠟油（0.5 mL / 只）預處理，7 天后接種雜交瘤細胞（1×10^6 個 / 只）；
   • 7-10 天后收集腹水，4℃離心（3000 rpm，10 分鐘），上清經 0.22 μm 濾膜過濾。

2. 細胞培養（小規模生產）

   • 雜交瘤細胞在無血清培養基（如 SFM4CHO）中懸浮培養，收集上清（抗體濃度約 50-200 μg/mL）。

3. 抗體純化

   • 腹水純化：先用 50% 硫酸銨沉淀去除雜蛋白，再通過 Protein G 親和層析（針對 IgG 類抗體）或離子交換層析進一步純化，PBS 透析脫鹽；
   • 上清純化：直接經親和層析或超濾（10 kDa 截留分子量）濃縮，SDS-PAGE 驗證純度。

（五）抗體鑒定與質量控制

1. 效價測定

   • ELISA 法檢測腹水抗體效價（應≥1:10^5），上清效價≥1:10^3。

2. 特異性驗證

   • Western blot：檢測抗體與天然 CHW 或重組 CHW 的結合特異性，同時驗證是否與犬其他激素（如胰島素、IGF）交叉反應；
   • 免疫組化：對妊娠犬胎盤組織切片進行染色，確認抗體對 CHW 的定位特異性（如滋養層細胞表達）。

3. 亞型與親和力測定

   • 用小鼠單克隆抗體亞型試劑盒確定 Ig 亞型（如 IgG1、IgM）；
   • 表面等離子共振（SPR）或 ELISA 競爭法測定抗體與 CHW 的親和力（KD 值≤10^-8 M 為高親和力）。

三、關鍵技術難點與解決方案 難點 解決方案 CHW 抗原免疫原性弱 優化重組表達系統（如真核表達保持二硫鍵），選擇 KLH 作為載體蛋白，增加免疫次數 雜交瘤細胞融合效率低 使用對數生長期骨髓瘤細胞，PEG 作用溫度精確控制在 37℃，融合后及時換液 非特異性抗體干擾 純化抗原時增加洗滌步驟，克隆化時嚴格篩選，并用天然 CHW 驗證交叉反應 抗體親和力不足 采用高親和力克隆篩選方法（如 SPR），或通過抗體工程技術（如 CDR 區突變）優化 四、應用場景

1. 臨床診斷

   • 制備犬妊娠檢測試紙條（檢測血清 / 尿液中 CHW 水平），用于早期妊娠診斷或流產預警；
   • 開發 ELISA 試劑盒，輔助診斷犬子宮蓄膿、卵巢功能異常等繁殖疾病。

2. 基礎研究

   • 免疫熒光定位 CHW 在犬生殖器官中的表達分布；
   • 免疫沉淀（IP）結合質譜分析 CHW 互作蛋白，研究其信號通路。

3. 藥物研發

   • 作為工具抗體篩選 CHW 受體拮抗劑，用于治療犬早產或異常妊娠；
   • 抗體偶聯藥物（ADC）研究（實驗階段），靶向遞送藥物至 CHW 高表達組織。

五、注意事項

1. 抗原構象：CHW 含二硫鍵，重組表達時需確保正確折疊，否則可能影響抗體識別表位；
2. 動物倫理：免疫實驗需符合 AAALAC 或當地動物保護法規，使用鎮痛劑減少動物應激；
3. 保存條件：純化抗體分裝后 - 20℃保存（避免反復凍融），加入 0.02% 疊氮鈉防止污染；
4. 應用優化：根據實驗目的（如診斷或研究）調整抗體工作濃度，通過預實驗確定最佳條件。

通過上述流程制備的犬松弛素單克隆抗體，可滿足從基礎研究到臨床應用的多場景需求，其核心在于抗原設計的合理性、雜交瘤篩選的嚴謹性及抗體功能的系統性驗證。