熒光定量 PCR 中無 Ct 值或 Ct 值過晚，該如何解決？_abio生物試劑品牌網
在熒光定量 PCR 實驗里，無 Ct 值出現和 Ct 值過晚是常讓科研人員頭疼的問題。這些問題會嚴重干擾實驗結果的準確性與可靠性，接下來我們就深入探討下背后的原因和解決辦法。
一、無 Ct 值出現的原因及解決辦法
（一）循環數設置不合理
正常情況下，PCR 循環數一般不宜超過 45 循環。要是循環數設置不足，可能因擴增產物量不夠，熒光信號沒達到可檢測水平，導致無 Ct 值。比如在一些低拷貝數模板的檢測中，若循環數只設 30 次，很可能就檢測不到產物。
解決辦法：依據實驗經驗和模板預估量，合理增加循環數，不過要注意，循環數過高也會使背景值提高，定量不準，通常調整到 35 - 40 循環較為合適。
（二）PCR 程序里檢測熒光信號步驟有誤
不同熒光定量方法，采集熒光信號的時機有別。像 SG 法一般在 72℃延伸時采集，TaqMan 法則多在退火結束或延伸時采集。要是 PCR 程序設置時，熒光采集步驟和所用方法不匹配，或者壓根沒勾選熒光采集選項，那肯定檢測不到熒光信號，也就沒有 Ct 值。
解決辦法：仔細核對所用熒光定量方法的說明書，嚴格按要求設置 PCR 程序里熒光信號檢測步驟，確保準確采集熒光信號。
（三）引物或探針降解
引物或探針降解后，無法正常和模板結合并引導擴增，自然不會有擴增產物，也就無 Ct 值。可通過 PAGE 電泳檢測引物和探針是否降解，降解的引物或探針在電泳圖上會呈現出條帶模糊、拖尾等異常。
解決辦法：重新合成高質量引物和探針，注意引物和探針的保存條件，避免反復凍融，最好小量分裝，存放在 - 20℃或 - 80℃。
（四）模板降解或上樣量不足
模板降解，完整性被破壞，擴增難以進行；上樣量不足，起始模板拷貝數少，擴增產物量也會很少，導致熒光信號弱，檢測不到 Ct 值。一般模板上樣量不超 500ng，對未知濃度樣本，應從系列稀釋樣本的最高濃度開始實驗。另外，樣本準備過程中引入雜質、反復凍融，都可能造成模板降解。
解決辦法：優化樣本提取和保存方法，確保模板質量。提取后盡快實驗，如需保存，將模板樣本小量分裝儲備，避免反復凍融。實驗前，用核酸定量儀精確測定模板濃度，依據濃度調整上樣量。
（五）引物探針設計不合理
引物設計要是不合理，像上下游引物 Tm 值差異超 4℃，會影響擴增效率，甚至導致擴增失敗，沒有 Ct 值；引物若不能跨越內含子，擴增基因組 DNA 時，可能受內含子干擾，影響結果。
解決辦法：借助專業引物設計軟件，如 Primer Premier 5.0 等，精心設計引物。設計好后，進行 BLAST 比對，確保引物特異性，避免與其他基因序列有過多同源性。
二、Ct 值過晚的原因及解決辦法
（一）擴增效率低
（二）PCR 程序不合適
（三）MgCl?濃度不合適
Mg2?是 Taq 酶活性必需離子，濃度過高或過低，都會影響 Taq 酶活性和擴增效率。濃度過高，可能增加非特異性擴增；過低，Taq 酶活性受抑制。
解決辦法：依據所用 PCR 試劑盒推薦，適當調整 MgCl?濃度，通過預實驗確定最適濃度。
（四）PCR 產物過長
PCR 產物設計超過 500bp，擴增難度會增加，所需時間更長，導致 Ct 值過晚。因為長片段擴增對反應條件要求更嚴苛，容易出現擴增效率低的問題。
解決辦法：重新設計引物，縮短 PCR 產物長度，一般控制在 100 - 300bp，更利于高效擴增。
（五）模板中存在抑制物
模板提取過程中，若混入蛋白質、多糖、有機溶劑等雜質，這些物質可能抑制 Taq 酶活性，降低擴增效率，使 Ct 值過晚。
解決辦法：使用高純度模板進行 PCR 檢測，或對模板進行稀釋，降低抑制物濃度。也可采用模板純化試劑盒，進一步去除雜質。
一、無 Ct 值出現的原因及解決辦法
（一）循環數設置不合理
正常情況下，PCR 循環數一般不宜超過 45 循環。要是循環數設置不足，可能因擴增產物量不夠，熒光信號沒達到可檢測水平，導致無 Ct 值。比如在一些低拷貝數模板的檢測中，若循環數只設 30 次，很可能就檢測不到產物。
解決辦法：依據實驗經驗和模板預估量，合理增加循環數，不過要注意，循環數過高也會使背景值提高，定量不準，通常調整到 35 - 40 循環較為合適。
（二）PCR 程序里檢測熒光信號步驟有誤
不同熒光定量方法，采集熒光信號的時機有別。像 SG 法一般在 72℃延伸時采集，TaqMan 法則多在退火結束或延伸時采集。要是 PCR 程序設置時，熒光采集步驟和所用方法不匹配，或者壓根沒勾選熒光采集選項，那肯定檢測不到熒光信號，也就沒有 Ct 值。
解決辦法：仔細核對所用熒光定量方法的說明書，嚴格按要求設置 PCR 程序里熒光信號檢測步驟，確保準確采集熒光信號。
（三）引物或探針降解
引物或探針降解后，無法正常和模板結合并引導擴增，自然不會有擴增產物，也就無 Ct 值。可通過 PAGE 電泳檢測引物和探針是否降解，降解的引物或探針在電泳圖上會呈現出條帶模糊、拖尾等異常。
解決辦法：重新合成高質量引物和探針，注意引物和探針的保存條件，避免反復凍融，最好小量分裝，存放在 - 20℃或 - 80℃。
（四）模板降解或上樣量不足
模板降解，完整性被破壞，擴增難以進行；上樣量不足，起始模板拷貝數少，擴增產物量也會很少，導致熒光信號弱，檢測不到 Ct 值。一般模板上樣量不超 500ng，對未知濃度樣本，應從系列稀釋樣本的最高濃度開始實驗。另外，樣本準備過程中引入雜質、反復凍融，都可能造成模板降解。
解決辦法：優化樣本提取和保存方法，確保模板質量。提取后盡快實驗，如需保存，將模板樣本小量分裝儲備，避免反復凍融。實驗前，用核酸定量儀精確測定模板濃度，依據濃度調整上樣量。
（五）引物探針設計不合理
引物設計要是不合理，像上下游引物 Tm 值差異超 4℃，會影響擴增效率，甚至導致擴增失敗，沒有 Ct 值；引物若不能跨越內含子，擴增基因組 DNA 時，可能受內含子干擾，影響結果。
解決辦法：借助專業引物設計軟件，如 Primer Premier 5.0 等，精心設計引物。設計好后，進行 BLAST 比對，確保引物特異性，避免與其他基因序列有過多同源性。
二、Ct 值過晚的原因及解決辦法
（一）擴增效率低
- 引物間或引物與探針比例不當：引物和探針濃度不合適，比如引物濃度過高，可能形成引物二聚體，競爭模板結合位點，降低擴增效率；引物和探針比例失衡，也會影響擴增。
- 引物或探針設計不合理：引物長度、GC 含量、特異性等不合適，都可能致使擴增效率低，Ct 值過晚。比如引物長度過長，退火時難以和模板完全配對，影響擴增。
（二）PCR 程序不合適
- 改用三步法反應：兩步法反應中，退火和延伸在同一溫度進行，可能對某些模板和引物組合效果欠佳。三步法將退火、延伸分開，能更好優化反應條件。
- 優化退火 / 延伸溫度：退火溫度過高，引物和模板結合不充分；過低，易產生非特異性擴增。延伸溫度不合適，會影響 Taq 酶活性和擴增效率。
- 延長退火 / 延伸時間：退火或延伸時間過短，引物和模板結合不充分，擴增產物合成不完全，導致 Ct 值過晚。
（三）MgCl?濃度不合適
Mg2?是 Taq 酶活性必需離子，濃度過高或過低，都會影響 Taq 酶活性和擴增效率。濃度過高，可能增加非特異性擴增；過低，Taq 酶活性受抑制。
解決辦法：依據所用 PCR 試劑盒推薦，適當調整 MgCl?濃度，通過預實驗確定最適濃度。
（四）PCR 產物過長
PCR 產物設計超過 500bp，擴增難度會增加，所需時間更長，導致 Ct 值過晚。因為長片段擴增對反應條件要求更嚴苛，容易出現擴增效率低的問題。
解決辦法：重新設計引物，縮短 PCR 產物長度，一般控制在 100 - 300bp，更利于高效擴增。
（五）模板中存在抑制物
模板提取過程中，若混入蛋白質、多糖、有機溶劑等雜質，這些物質可能抑制 Taq 酶活性，降低擴增效率，使 Ct 值過晚。
解決辦法：使用高純度模板進行 PCR 檢測，或對模板進行稀釋，降低抑制物濃度。也可采用模板純化試劑盒，進一步去除雜質。
本站“ABIO生物試劑品牌網”圖片文字來自互聯網
如果有侵權請聯系微信: nanhu9181 處理，感謝~
