利用11種顏色的光譜分離實現(xiàn)超多標(biāo)記_abio生物試劑品牌網(wǎng)
利用共聚焦顯微鏡的擴展光譜能力和多色混色工具
熒光顯微鏡
是生命科學(xué)研究的基本工具，隨著細胞組織和模式生物多色標(biāo)記策略的發(fā)展而不斷發(fā)展和成熟。分子特異性標(biāo)記多種物種的能力需要適當(dāng)?shù)墓ぞ邅碜R別樣品中的多種熒光標(biāo)簽。
嚴(yán)格分離多個標(biāo)簽 對于獲得有意義的成分、豐度、結(jié)構(gòu)和功能讀數(shù)至關(guān)重要。這種所謂的超多標(biāo)技術(shù)在揭示組織結(jié)構(gòu)、癌癥進展、腫瘤免疫相互作用和傳染病機制等關(guān)鍵方面已變得十分突出 [1-4]。
為什么需要超多標(biāo)？
簡單的多色實驗通常使用三種不同的熒光團，它們在可見光譜的藍色、綠色和紅色區(qū)域有不同的發(fā)射。然而，生物樣本和過程的復(fù)雜性不斷增加，這就在技術(shù)和應(yīng)用方面提出了更高的要求，需要 能在中倍數(shù)（大于 10 個熒光團）范圍內(nèi)同時成像的方法 [5-7]。
挑戰(zhàn)
實現(xiàn)多重化的一種方法是使用上述藍、綠、紅熒光團對樣品進行迭代染色和成像。然而，這一過程非常耗時，而且由于每輪染色都需要進行苛刻的處理，可能會影響樣本的完整性和質(zhì)量。此外，合并數(shù)據(jù)的圖像處理也很麻煩，尤其是在三維組織樣本中。因此， 在更復(fù)雜的多重染色應(yīng)用中，在一輪染色中達到所需的多重染色水平的策略已成為理想選擇。雖然純粹從樣品制備的角度來看，增加樣品中不同熒光團的數(shù)量是研究人員可以完成的任務(wù)，但如何處理多個熒光團激發(fā)或發(fā)射光譜的重疊問題，即使對經(jīng)驗豐富的研究人員來說也是一項挑戰(zhàn)。熒光團的交叉激發(fā)和發(fā)射光譜的串?dāng)_或透射使得區(qū)分不同信號變得尤為困難。因此， 樣品上每增加一個熒光團，都會增加正確分離每個標(biāo)簽的難度。
研究方法
圖 1：本文使用的與珠子耦合的 Alexa Fluor 染料的激發(fā)光譜（A）和發(fā)射光譜（B）。光譜由 FPbase [8] (www.fpbase.org)生成。
圖 2：（A）11 色微珠（標(biāo)稱直徑 0.8 微米）樣品的原始圖像；（B）利用 STELLARIS 中集成的染料分離工具獲得的圖像。AF 405（藍色）、AF 532（灰色）、AF 594（橙色）、AF 750（青色）、AF 488（淺綠色）、AF 555（黃色）、AF 647（洋紅色）、AF 790（紅色）、AF 514（綠色）、AF 568（紫色）、AF 700（淺黃色）。
為了評估染料分離的效率，我們量化了不同通道中單個珠子上每種熒光團的串?dāng)_（圖 3）。在理想情況下，每個珠子只出現(xiàn)在一個通道中，因為我們只用一種熒光團標(biāo)記它們。為了量化，我們使用了嵌入 Fiji 自動閾值處理功能的最大熵算法 [9] [10]，對每個通道（圖 3B 中顯示為品紅色）的對象（珠子，圖 3A）進行了分割，并測量了所有通道的歸一化平均強度。歸一化平均強度值顯示在直方圖中（圖 3C）。我們的分析證實， 每個熒光團都被分配到一個通道，11 個不同標(biāo)記的珠子可以清楚地分成各自的通道。
圖 3：評估 11 色珠樣品圖像中的染料分離效率。使用染料分離工具成像后獲得的通道（A）使用 MaxEntropy Dark 進行了閾值化和分割（B）。計算不同通道之間的串?dāng)_，并繪制每個通道的串?dāng)_圖 (C)。
總結(jié)
總的結(jié)果是成功地對與合成珠耦合的 11 種不同熒光團進行了光譜分離，充分展現(xiàn)了 STELLARIS 共聚焦平臺在進行多重標(biāo)記分析方面的顯著能力。
參考文獻：
[1] IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyPIng and spatial analysis of cells in complex tissues. Radtke, A. J. et al., PNAS, 2020. doi: 10.1073/pnas.2018488117.[2] Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Stack, E. C. et al., Methods, 2014. doi: 10.1016/j.ymeth.2014.08.016.
[3] Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Tan, W. C., et al., Cancer Comm (Lond), 2020. doi: 10.1002/cac2.12023.
[4] Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Lewis, S. M.,et al., Nat. Methods, 2021. doi: 10.1038/s41592-021-01203-6.
[5] Spectral Imaging and Linear Unmixing in Light Microscopy. Zimmermann, T., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2005. doi: 10.1007/b102216.
[6] Hyperspectral phasor analysis enables multiplexed 5D in vivo imaging. Cutrale, F., et al., Nat. Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4134.
[7] PICASSO allows ultra-multiplexed fluorescence imaging of spatially overlapping proteins without reference spectra measurements. Seo, J., et al., Nat. Comm., 2022. doi: 10.1038/s41467-022-30168-z.
[8] FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Lambert, T. J., et al., Nat. Methods, 2019. doi: 10.1038/s41592-019-0352-8.
[9] A new method for gray-level picture thresholding using the entropy of the histogram. Kapur, J. N., et al., Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 1985. doi:10.1016/0734-189x(85)90125-2.
[10] Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Schindelin, J., et al., Nat. Methods, 2012. doi:10.1038/nmeth.2019.
相關(guān)產(chǎn)品
STELLARIS共聚焦顯微鏡平臺
SpectraPlex
申請樣機試用
熒光顯微鏡
是生命科學(xué)研究的基本工具，隨著細胞組織和模式生物多色標(biāo)記策略的發(fā)展而不斷發(fā)展和成熟。分子特異性標(biāo)記多種物種的能力需要適當(dāng)?shù)墓ぞ邅碜R別樣品中的多種熒光標(biāo)簽。
嚴(yán)格分離多個標(biāo)簽 對于獲得有意義的成分、豐度、結(jié)構(gòu)和功能讀數(shù)至關(guān)重要。這種所謂的超多標(biāo)技術(shù)在揭示組織結(jié)構(gòu)、癌癥進展、腫瘤免疫相互作用和傳染病機制等關(guān)鍵方面已變得十分突出 [1-4]。
為什么需要超多標(biāo)？
簡單的多色實驗通常使用三種不同的熒光團，它們在可見光譜的藍色、綠色和紅色區(qū)域有不同的發(fā)射。然而，生物樣本和過程的復(fù)雜性不斷增加，這就在技術(shù)和應(yīng)用方面提出了更高的要求，需要 能在中倍數(shù)（大于 10 個熒光團）范圍內(nèi)同時成像的方法 [5-7]。
挑戰(zhàn)
實現(xiàn)多重化的一種方法是使用上述藍、綠、紅熒光團對樣品進行迭代染色和成像。然而，這一過程非常耗時，而且由于每輪染色都需要進行苛刻的處理，可能會影響樣本的完整性和質(zhì)量。此外，合并數(shù)據(jù)的圖像處理也很麻煩，尤其是在三維組織樣本中。因此， 在更復(fù)雜的多重染色應(yīng)用中，在一輪染色中達到所需的多重染色水平的策略已成為理想選擇。雖然純粹從樣品制備的角度來看，增加樣品中不同熒光團的數(shù)量是研究人員可以完成的任務(wù)，但如何處理多個熒光團激發(fā)或發(fā)射光譜的重疊問題，即使對經(jīng)驗豐富的研究人員來說也是一項挑戰(zhàn)。熒光團的交叉激發(fā)和發(fā)射光譜的串?dāng)_或透射使得區(qū)分不同信號變得尤為困難。因此， 樣品上每增加一個熒光團，都會增加正確分離每個標(biāo)簽的難度。
研究方法
STELLARIS 共聚焦平臺就是為這些應(yīng)用而設(shè)計的。下一代 WLL 超連續(xù)激發(fā)、AOBS、優(yōu)化的光束路徑和多達 5 個 Power HyD 探測器同時工作，實現(xiàn)了超靈活的光譜能力，確保更大限度地收集來自每個相關(guān)標(biāo)記的光子。 集成在 ImageCompass 用戶界面中的光譜非混合工具使復(fù)雜熒光團組合的分離成為可能。
例如，我們概述了在一輪染色和成像中對 11 種不同熒光團進行成像的一種方法。我們定義了一組光譜不同的熒光團，并通過 STELLARIS 中的線性非混合通道染料分離工具將其分離。為了說明這種方法是如何工作的，我們選擇了11種Alexa Fluor（AF）染料，范圍從AF 405 nm到AF 790 nm（圖1），與鏈霉親和素連接。然后，我們將每種熒光團與涂有生物素的聚苯乙烯珠子耦合，純化珠子，并將它們的混合物裝入 Prolong Diamond 玻璃蓋玻片上。使用配備了 5 Power HyD 檢測器的 STELLARIS 顯微鏡對 11 色樣品進行成像（圖 2）。
圖 1：本文使用的與珠子耦合的 Alexa Fluor 染料的激發(fā)光譜（A）和發(fā)射光譜（B）。光譜由 FPbase [8] (www.fpbase.org)生成。
圖 2：（A）11 色微珠（標(biāo)稱直徑 0.8 微米）樣品的原始圖像；（B）利用 STELLARIS 中集成的染料分離工具獲得的圖像。AF 405（藍色）、AF 532（灰色）、AF 594（橙色）、AF 750（青色）、AF 488（淺綠色）、AF 555（黃色）、AF 647（洋紅色）、AF 790（紅色）、AF 514（綠色）、AF 568（紫色）、AF 700（淺黃色）。
為了評估染料分離的效率，我們量化了不同通道中單個珠子上每種熒光團的串?dāng)_（圖 3）。在理想情況下，每個珠子只出現(xiàn)在一個通道中，因為我們只用一種熒光團標(biāo)記它們。為了量化，我們使用了嵌入 Fiji 自動閾值處理功能的最大熵算法 [9] [10]，對每個通道（圖 3B 中顯示為品紅色）的對象（珠子，圖 3A）進行了分割，并測量了所有通道的歸一化平均強度。歸一化平均強度值顯示在直方圖中（圖 3C）。我們的分析證實， 每個熒光團都被分配到一個通道，11 個不同標(biāo)記的珠子可以清楚地分成各自的通道。
圖 3：評估 11 色珠樣品圖像中的染料分離效率。使用染料分離工具成像后獲得的通道（A）使用 MaxEntropy Dark 進行了閾值化和分割（B）。計算不同通道之間的串?dāng)_，并繪制每個通道的串?dāng)_圖 (C)。
總結(jié)
總的結(jié)果是成功地對與合成珠耦合的 11 種不同熒光團進行了光譜分離，充分展現(xiàn)了 STELLARIS 共聚焦平臺在進行多重標(biāo)記分析方面的顯著能力。
參考文獻：
[1] IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyPIng and spatial analysis of cells in complex tissues. Radtke, A. J. et al., PNAS, 2020. doi: 10.1073/pnas.2018488117.[2] Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Stack, E. C. et al., Methods, 2014. doi: 10.1016/j.ymeth.2014.08.016.
[3] Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Tan, W. C., et al., Cancer Comm (Lond), 2020. doi: 10.1002/cac2.12023.
[4] Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Lewis, S. M.,et al., Nat. Methods, 2021. doi: 10.1038/s41592-021-01203-6.
[5] Spectral Imaging and Linear Unmixing in Light Microscopy. Zimmermann, T., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2005. doi: 10.1007/b102216.
[6] Hyperspectral phasor analysis enables multiplexed 5D in vivo imaging. Cutrale, F., et al., Nat. Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4134.
[7] PICASSO allows ultra-multiplexed fluorescence imaging of spatially overlapping proteins without reference spectra measurements. Seo, J., et al., Nat. Comm., 2022. doi: 10.1038/s41467-022-30168-z.
[8] FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Lambert, T. J., et al., Nat. Methods, 2019. doi: 10.1038/s41592-019-0352-8.
[9] A new method for gray-level picture thresholding using the entropy of the histogram. Kapur, J. N., et al., Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 1985. doi:10.1016/0734-189x(85)90125-2.
[10] Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Schindelin, J., et al., Nat. Methods, 2012. doi:10.1038/nmeth.2019.
相關(guān)產(chǎn)品
STELLARIS共聚焦顯微鏡平臺SpectraPlex申請樣機試用
本站“ABIO生物試劑品牌網(wǎng)”圖片文字來自互聯(lián)網(wǎng)
如果有侵權(quán)請聯(lián)系微信: nanhu9181 處理，感謝~
