方案摘要：本方案主要探討 PIpetty 電動(dòng)移液器在基孔肯雅病毒核酸（蝕斑減少中和試驗(yàn)）檢測(cè)中的具體應(yīng)用。這款移液器擁有輕便小巧的特點(diǎn)，重量?jī)H 75g，操作起來十分舒適。同時(shí)，它具備高精度的等量連續(xù)分液能力，能夠按照設(shè)定的移液量進(jìn)行多次重復(fù)排液，并且配備了溫度控制功能，可避免因手部熱量影響而導(dǎo)致的精度降低。在檢測(cè)流程里，無論是樣本稀釋還是連續(xù)加樣等關(guān)鍵步驟，該移液器都能發(fā)揮積極作用，有效提高檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性，減少實(shí)驗(yàn)過程中的誤差，為基孔肯雅病毒的檢測(cè)工作提供堅(jiān)實(shí)可靠的支持。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       血清中CHIKV中和抗體可阻斷病毒吸附細(xì)胞，而未被中和的病毒仍具有感染細(xì)胞的能力，可導(dǎo)致單層細(xì)胞病變、脫落等，形成一個(gè)局限性的變性細(xì)胞區(qū)，該區(qū)稱之為蝕斑。在單層細(xì)胞上覆蓋含有活性染料的營(yíng)養(yǎng)瓊脂可指示蝕斑的多少。“蝕斑”是感染了病毒的細(xì)胞，病變死亡后無法被染料染上顏色，形成空斑，而未感染病毒的細(xì)胞可被活性染料著色，通過顏色的對(duì)比可判定蝕斑量。檢測(cè)血清的中和抗體時(shí)，需用已知蝕斑滴定度的參考毒株與待檢血清反應(yīng)，蝕斑數(shù)減少表示血清有中和活性，中和反應(yīng)后能引起50%蝕斑減少的血清稀釋度的倒數(shù)即為蝕斑減少中和抗體的滴度。蝕斑減少中和試驗(yàn)檢測(cè)基孔肯雅病毒中和抗體實(shí)驗(yàn)應(yīng)在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。
 
 
二、?實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① 4℃冰箱。
② 37℃水浴鍋。
③ 二氧化碳培養(yǎng)箱。
④ 無菌平底6孔組織培養(yǎng)板。
⑤ Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-02-1000及相應(yīng)量程吸頭。
 
1、試劑和材料
① 易感細(xì)胞：健康單層 Vero 細(xì)胞。
② 細(xì)胞生長(zhǎng)液：100mL生長(zhǎng)液中包含 Eagle'sMEM 溶液 88mL，10000IU/mL 青鏈霉素溶液1mL，1%谷氨酰胺1 mL，胎牛血清 10 mL用 7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)至 pH 7.2，用前混勻。
③ 細(xì)胞維持液：100mL維持液中包含 Eagle'sMEM溶液 96 mL，10 000 U/mL， 青鏈霉素溶液1mL，1%谷氨酰胺1mL，胎牛血清 2 mL，用 7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)至 pH 7.2，用前混勻。
④ 細(xì)胞消化液：2.5g胰酶溶于1000mL 無鈣鎂磷酸鹽緩沖液中，過濾除菌。
⑤ 病毒儲(chǔ)備液及其滴定：CHIKV 接種 Vero 細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病理性效應(yīng)(CPE)達(dá)+++后收獲病毒，離心后將上清分裝到無菌2mL 螺口血清管，凍存到-70℃冰箱作為病毒儲(chǔ)備液備用。使用前先取一支病毒液進(jìn)行病毒蝕斑形成單位(PFU)滴定。具體操作步驟為：
（a）準(zhǔn)備3塊已長(zhǎng)成單層的 VER0細(xì)胞6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并編號(hào);
（b）將病毒液用維持液做連續(xù) 10 倍稀釋至 10-8，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，然后從最高稀釋度起將各稀釋度的病毒液加到 6孔細(xì)胞板中，每個(gè)稀釋度加兩孔，每孔 100μL，最后兩孔作細(xì)胞對(duì)照，37℃吸附1h;
（c）準(zhǔn)備 1%瓊脂培養(yǎng)基，并使其保溫在 43℃，病毒吸附結(jié)束后加入瓊脂培養(yǎng)基到各細(xì)胞孔，每孔 3mL，輕柔搖晃混勻，確保瓊脂將病毒液完全覆蓋，大約20min后，瓊脂完全凝固，將平板倒置放入 C02培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)；
（d）每天觀察計(jì)數(shù)蝕斑量，并在細(xì)胞板的背面用記號(hào)筆圈出蝕斑；如果接種 10-4稀釋度的病毒孔的蝕斑無法計(jì)數(shù)，接種 10-5稀釋度病毒的兩個(gè)細(xì)胞孔中平均有 100個(gè)蝕斑，那么病毒的滴度為107PFU /mL。
⑥ 其他試劑：陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、待測(cè)血清標(biāo)本、牛血清白蛋白(BSA)、PH7.4的 Tris緩沖液、瓊脂糖、中性紅。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、待檢血清在 56℃水浴滅活 30 min，除去血清中的補(bǔ)體和其他干擾因子。
2、使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置自動(dòng)混勻功能，用含 1% BSA 的維持液稀釋病毒至每100μL含有200個(gè)蝕斑單位(200 PFU/0.1 mL)。
 
3、使用自動(dòng)混勻功能，用含 1% BSA 的維持液將待檢血清先做1∶5稀釋，然后做連續(xù)2倍稀釋至 1∶160 或是所需要的滴度，并保證每個(gè)稀釋度的工作容量為100μL。
4、取稀釋好的 200 PFU/0.1 mL的病毒液100μL，分別加入100μL不同稀釋度的血清中，自動(dòng)混勻后，4℃孵育過夜，或者 37℃孵育 1h。
 
5、取稀釋好的 200 PFU/0.1 mL的病毒液 500μL，加入等量的含1% BSA 的維持液，自動(dòng)混勻模式，一鍵混勻，然后對(duì)病毒液做連續(xù) 10 倍稀釋，包括:10-1 和 10-2，這些混合稀釋液各自的最終病毒含量要達(dá)到 100PFU/0.1 mL、10 PFU/0.1 mL 和1 PFU/0.1 mL，最后對(duì)病毒液做回滴，并且病毒回滴液和病毒血清混合液在同樣條件下孵育。
6、孵育結(jié)束后，先將6孔板中的單層細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，然后加入病毒-血清混合液，設(shè)置連續(xù)分液功能，每次分液100微升，連續(xù)分液6次，每孔等量加入 100μL。用另外一塊細(xì)胞培養(yǎng)板加入用于病毒回滴的病毒稀釋液，各稀釋度加兩孔，37℃吸附1 h。
 
7、準(zhǔn)備含中性紅的1%瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基，加熱使其完全溶解后放置 43℃水浴使其保持液體狀態(tài)備用，含有中性紅染料的營(yíng)養(yǎng)瓊脂配方為：維持液中加1%瓊脂和0.4%中性紅。
8、將上述 1%瓊脂培養(yǎng)基逐一加入病毒血清反應(yīng)孔和病毒回滴孔中，每孔加入3mL，輕柔搖晃混勻，確保瓊脂將病毒-血清混合液完全覆蓋。
9、大約 20 min 后，瓊脂完全凝固，將平板倒置放入C02培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。每天觀察計(jì)數(shù)蝕斑量，并在倒置的平板上用記號(hào)筆圈出蝕斑。
四、結(jié)果判讀
1、病毒回滴試驗(yàn)是為了確定加入的病毒量是否合適，計(jì)算病毒回滴試驗(yàn)中的蝕斑數(shù)，計(jì)算平行孔中的蝕斑數(shù)平均值，只有蝕斑量在 30~100之間時(shí)才計(jì)算試驗(yàn)孔中的蝕斑量，最后計(jì)算中和抗體滴度。
2、陽性血清對(duì)照成立，測(cè)定抗體滴度在已知抗體滴度的上下一個(gè)稀釋度范圍內(nèi)；同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)照孔，對(duì)照孔細(xì)胞形態(tài)正常則所做試驗(yàn)結(jié)果可靠。只有試驗(yàn)孔出現(xiàn) 90%的蝕斑量減少現(xiàn)象才可判定出現(xiàn)了免疫中和反應(yīng)。比如，逆滴定表明己知攻擊病毒滴度為 100 PFU/0.1 mL，那么≤10個(gè)蝕斑量的血清稀釋度就是終點(diǎn)。
3、能中和病毒的最高血清稀釋度的倒數(shù)就是蝕斑減少中和抗體滴度。