方案摘要：本方案聚焦 PIpetty 電動(dòng)移液器在基孔肯雅病毒核酸 RT-PCR 檢測(cè)中的應(yīng)用。其在病毒 RNA 提取時(shí)精準(zhǔn)添加試劑，保障模板質(zhì)量；配置反應(yīng)體系用連續(xù)分液模式分裝混合液；同時(shí)，其具備溫度補(bǔ)償功能、能減少人為誤差，提升效率與準(zhǔn)確性，且維護(hù)成本低、合規(guī)性強(qiáng)，為檢測(cè)提供有力支持，保障結(jié)果的精準(zhǔn)與可重復(fù)。該移液器提升了檢測(cè)準(zhǔn)確性與效率，為病毒檢測(cè)規(guī)范化提供有力支持，是檢測(cè)工作的重要工具。
 
方案詳情：

• 實(shí)驗(yàn)原理

病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下先轉(zhuǎn)錄成模板cDNA，然后在聚合酶的作用下合成特異DNA片段，擴(kuò)增主要由變性、退火和延伸三個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)構(gòu)成：即在高溫（95℃）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（37℃~55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在適宜溫度下（72℃）經(jīng)Tag酶催化，以引物3'端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成新的DNA鏈。
二、? 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250及配套吸頭；
② 離心管（1.5m、0.2 mL 和 0.1 mL）；
③ 試管架（5 mL、1.5L 和 20  ）；
④ 高速冷凍離心機(jī)；
⑤ 旋渦混合器；
⑥ 恒溫振蕩器；
⑦ PCR 儀等。
 
2、試劑和材料
① CHIKV 特異性引物（ CHIKV-F，CHIKV-R）；
② RNA 提取試劑；
③ 一步法 RT-PCR 檢測(cè)試劑；
④ CHIKV-F：5’-GGGCGGGTAGTCCATGTTGTAGA-3'
   CHIKV-R：5’-ACCGGCGTCTACCCATTCATGT-3'。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、病毒 RNA 提取：待檢標(biāo)本用病毒 RNA 提取試劑盒提取，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，制備的病毒核酸作為 Real-time RT-PCR 的模板。此過(guò)程中可使用 Pipetty 電動(dòng)移液器進(jìn)行試劑的添加，如在使用離心柱法提取時(shí)，準(zhǔn)確吸取裂解液、洗滌緩沖液等試劑加入到樣本中。
2、配置反應(yīng)體系，根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)置陰性、陽(yáng)性、內(nèi)參對(duì)照。根據(jù)需要檢測(cè)的樣品數(shù)量，配制反應(yīng)體系。將混合液、引物、探針、水充分混勻后分裝，使用 Pipetty 電動(dòng)移液器的連續(xù)分液模式，設(shè)置每次分液量和連續(xù)分液次數(shù)，每管分液 15μL，轉(zhuǎn)移反應(yīng)管至樣品制備區(qū)。
 
3、加入 RNA 模板：更換吸頭，設(shè)置分液量和分液次數(shù)，吸取 RNA 溶液，在反應(yīng)管中分別加入 5μL RNA，使每管總體積達(dá)到 20μL，記錄反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)。操作過(guò)程中，每次操作都要更換新的滅菌吸頭，嚴(yán)防不同樣品間的交叉污染。
4、一步法 RT-PCR 擴(kuò)增：反應(yīng)條件為：逆轉(zhuǎn)錄 50℃ 30 min；PCR 反應(yīng)，94℃ 2 min 一次，再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94℃ 30s，57℃ 30 s，68℃ 40 s，最后再以68℃ 5 min 結(jié)束。該反應(yīng)條件可根據(jù)不同的試劑進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
 
四、試驗(yàn)結(jié)果
RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果條帶的分子量與預(yù)期片段大小（330bp）相同，可判定CHIKV核酸擴(kuò)增陽(yáng)性。