本文要點：短波紅外（SWIR）區域的熒光成像已成為研究哺乳動物的重要工具。目前，聚甲炔染料在體內成像應用中的進展主要受限于疏水性和/或非特異性蛋白結合。本文采用獨特方法結合親水性與隱匿行為，通過精確設計的聚(2-甲基-2-?f唑啉)（POx）星形聚合物結構構建高亮度短波紅外發射色烯?f熒光團，命名為色烯?f星（或稱"CStars"）。在聚合物屏蔽染料中，含五條POx鏈的變體（CStar30）具有顯著增強的水溶性與短波紅外亮度，可實現小鼠體內高分辨率短波紅外成像；其體內展現的快速腎臟清除特性與隱匿行為還實現了淋巴系統無創可視化效果的提升。此外，CStar與FDA批準染料吲哚菁綠（ICG）促進雙色激發復用短波紅外成像，可在視頻速率幀數下實時同步觀測同一活體內的流體動力學與蛋白質動力學。

 

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本研究融合隱形聚合物與短波紅外發射聚甲炔熒光團優勢，采用精確設計的星形聚合物結構以保持造影劑的分子級離散性。星形聚合物以共同核心延伸出三條及以上聚合物鏈（"臂"）為特征，相比線性聚合物具有鏈纏結少、溶液粘度低等獨特性質。通過在星形聚合物核心植入短波紅外發射熒光團，推斷聚合物臂既能提供水溶性和體內隱形特性，又可作為分子屏障保護水環境中的熒光團。由此開發出色烯?f星形聚合物"CStars"：其核心為高亮度色烯?f熒光團，外圍延伸隱形親水性聚(2-甲基-2-?f唑啉)（POx）聚合物臂（圖1B）。將該材料與吲哚菁綠（ICG）聯用，最終實現小鼠體內雙色激發復用短波紅外成像，通過降低蛋白結合率顯著改變體內生物分布與清除速率（圖1C）。

 

圖1. 用于體內成像的聚甲氧基熒光團

 

本研究選用具有優異短波紅外亮度的七甲川色烯?f熒光團（Chrom7）作為CStars核心。通過結構修飾，使核心色烯?f骨架攜帶3-5個末端炔基，以便通過銅催化點擊化學進行聚合物偶聯。隱形聚合物臂選用疊氮功能化線性聚(2-甲基-2-?f唑啉)（POx），由對應單體聚合而成。本研究聚焦聚合度30的POx鏈，因其在膠束和納米乳劑中展現卓越親水性。采用"耦合接枝"策略將核心熒光團與聚合物臂結合——先獨立制備各組分再偶聯，成功制得分子量分布狹窄的星形聚合物（圖2A）。盡管大分子聚合物偶聯動力學緩慢，但銅催化疊氮-炔環加成反應（CuAAC）在此展現出高效性。

 

圖2. 點擊化學法合成鉻烯基星形聚合物（CStars）

 

為探究星形結構對染料性能的影響，制備了三種含不同炔基數目的核心熒光團。通過CuAAC反應高效合成了分子量分布極窄（?≤1.02）的CStars（5,6,7），分別含五臂、四臂及三臂POx鏈（圖2B,）。以5號材料優化反應條件發現：當每炔基配2當量POx聚合物及16% Cu(I)催化劑時，反應數小時內即可完全轉化。凝膠滲透色譜（GPC）、基質輔助激光解吸質譜（MALDI）（圖2C-E）分析表明偶聯反應高效穩定，不同批次產物重現性優異。隨著聚合物臂數量減少，尺寸排阻色譜與透析分離難度增加，導致分離收率逐步降低。

圖3. CStars和核心熒光團的光物理性質

 

在獲得五臂、四臂及三臂CStars材料（5–7）后，選用極性更強的甲醇（MeOH）直接對比核心熒光團與CStars亮度。值得欣慰的是，所有CStars均保持聚甲炔特征吸收/發射光譜，且相較對應核心熒光團產生約10 nm紅移（最大吸收波長λmax, abs～ 940 nm）。核心熒光團亮度（ΦF X εmax）在所有CStars中也得以維持或提升（圖3D）。這些數據共同表明：聚合物臂在改變核心熒光團溶解性的同時，能保留理想光物理特性。隨后評估了CStars結構抑制非輻射聚集并傳遞亮度至水相的能力。濃度匹配實驗顯示：吸收光譜隨臂數變化（圖3A），而發射光譜保持穩定（圖3B）。三臂CStar（7）在任何測試濃度下均未能實現單體發光型水相吸收譜。對比五臂與四臂CStars（5和6）在水中的光物理參數，5號材料憑借更高εmax與ΦF占據優勢（圖3D）。為直接對比水相短波紅外相對亮度，在974 nm激發下測量了毛細管中濃度匹配的各CStars變體發射強度。與光物理測量結果一致，5號材料在1100 nm以上波段展現出最強短波紅外發射強度（圖3C）。綜上可得出結論：五條聚合物臂在最大化水溶性及亮度方面最為理想，遂將五臂色烯?f星形聚合物（5）命名為CStar30，其中"30"代表每條POx聚合物臂所含MeOx重復單元數。

圖4. CStar30和SulfoChrom7在水和蛋白質溶液中的比較（光物理性質見圖3D）

 

接下來研究者評估了CStar30抵抗蛋白結合的能力。首先在純水和富含白蛋白及其他生物分子的胎牛血清（FBS）中檢測CStar30和SulfoChrom7（圖4）。令人振奮的是，CStar30在純水與FBS中均呈現單體吸收特征（圖4A），且短波紅外發射強度近乎一致（圖4C）。更重要的是，CStar30在純水中優異的光物理性質在FBS環境中依然保持穩定（圖3D）。相反，SulfoChrom7從純水到FBS環境中吸收光譜與短波紅外發射強度發生劇烈變化：其在純水中非輻射聚集占據主導，導致短波紅外發射近乎消失，而FBS環境則恢復了其發光單體狀態（圖4B,4D）。既往研究表明ICG存在類似現象。

生物環境穩定性對小分子染料而言歷來是嚴峻挑戰。前期研究顯示ICG和SulfoChrom7在生理溫度（37°C）下僅數小時即從溶液中大量降解。值得慶幸的是，CStar30在純水和FBS中的穩定性均顯著提升。特別是在谷胱甘肽（GSH）存在下，其穩定性大幅增強：1 mM GSH中20天后仍保留50%以上熒光團，10 mM GSH中更可持續55天。此外在相同條件下，CStar30在純水與FBS溶液中的光漂白速率較SulfoChrom7提升約10倍（圖4E）。綜上所述，CStar30的星形聚合物結構能更有效屏蔽水環境對熒光團的影響，其化學穩定性與光穩定性均顯著優于易結合蛋白的染料。

圖5. 小鼠CStar30的單色成像

 

在確認CStar30具備優異體外性能后，研究者進一步開展小鼠活體短波紅外成像實驗（圖5）。首次活體實驗采用尾靜脈注射CStar30（圖5A），立即觀察到腎臟富集現象（圖5B），隨時間推移膀胱信號持續增強。麻醉狀態下靜脈注射后血液循環時間估測為10-15分鐘。值得注意的是，當小分子聚甲炔染料因蛋白結合作用主要富集于肝臟時，CStar30在肝臟僅呈現基礎信號（圖5E,5F），提示其具有體內隱形特性。注射3小時后整體信號顯著減弱，1天后基本檢測不到。處死動物后離體器官微弱熒光強度與探針主體已清除的結果一致。

基于獨特的體內分布與快速清除特性，通過后足墊皮內注射將CStar30引入淋巴系統（圖5C）。皮內注射后，CStar30使淋巴結清晰顯影，結合高分辨率短波紅外檢測窗口實現了無創淋巴結識別（圖5D,5G）。活體實時監測顯示染料在淋巴管中的脈動傳輸，麻醉狀態下淋巴引流速度計算值約2.5 mm/min（圖5H）。盡管既往熒光淋巴成像研究在淋巴結識別與引流速度方面存在較大差異，研究者認為CStar30能最大限度減少與蛋白質及其他生物分子的非特異性相互作用，從而更精準呈現淋巴動力學過程。

圖6. CStar30和ICG在小鼠體內的雙色激發多路成像

 

為深入探究蛋白結合型與蛋白惰性熒光團在活體動力學的差異，采用ICG（蛋白結合型染料）與CStar30（蛋白惰性染料）進行激發多路復用雙色成像（圖6A）。選擇ICG因其光譜與CStar30分離，可分別通過786 nm和974 nm交替激發，在單一短波紅外發射窗口實現雙通道檢測（圖6B）。該方法支持視頻級成像速度的雙熒光團同步觀測。盡管ICG主要發射近紅外光，其微弱發射尾跡仍可在短波紅外波段顯現（需更高注射濃度）。最終確定15:100 μM（CStar30）的濃度比可有效消除激發通道串擾（圖6C），為活體雙色成像奠定基礎。

通過靜脈或皮下共注射兩種染料，研究者在同一動物體內直接比較熒光團的分布動力學與清除時程。靜脈注射后，ICG在2分鐘內流經血管并富集于肝臟（符合蛋白結合特性），而聚合物屏蔽的CStar30則同時抵達腎臟（圖6D）。麻醉狀態下持續監測30分鐘發現：ICG肝臟信號持續增強（圖6D藍色），CStar30腎臟信號在10分鐘開始下降，30分鐘時膀胱積聚最顯著（圖6D洋紅色）。注射3小時后，ICG在肝臟、胃腸呈現強信號，而CStar30腎臟信號趨近于零，膀胱殘留微弱。1天后CStar30信號完全消失，但ICG在注射2天后仍于網狀內皮系統（如肝臟）清晰可見（圖6D藍色），此為蛋白結合型染料的典型滯留特征。皮下共注射實驗顯示：兩種染料初期均富集于相同淋巴結（圖6E紫色），但ICG同步轉移至肝臟（圖6E藍色），而CStar30淋巴結滯留時間延長（注射后10分鐘內腎臟/膀胱信號微弱）。其淋巴結強信號可持續1小時（圖S29,S30），而ICG在注射2天后仍滯留于網狀內皮組織（圖6E藍色），CStar30則完全無法檢測。該結果證實蛋白結合會導致ICG干擾淋巴結定位及淋巴引流監測的時效性。

 

本研究將隱形親水性線性POx聚合物與短波紅外發射色烯?f七甲炔熒光團融合，開發了出色的烯?f星形聚合物（CStars）。評估維持水中短波紅外熒光核心亮度所需聚合物臂數量時，發現五臂構型最優，該修飾還極大提升了水環境下的化學穩定性與光穩定性。基于五臂結構（CStar30），星形聚合物在體外排斥蛋白相互作用，表現為純水與蛋白溶液中吸收光譜及短波紅外亮度的差異可忽略。作為該類別首例，研究者將CStar30通過靜脈與皮下注射應用于小鼠活體短波紅外成像，欣喜觀察到染料獨立于注射方式快速經腎臟清除——此為該類染料首次突破肝臟積聚瓶頸。皮下注射中還能實時監測淋巴結引流（疾病狀態的重要生物學標志），并在與ICG的激發多路復用成像實驗中，揭示星形聚合物架構相較蛋白結合小分子染料的體內分布與動力學差異。最終攻克水溶性短波紅外聚甲炔熒光團的生物分子互作壁壘，CStar架構有望顯著推進無創臨床實踐（如腎功能與淋巴引流監測），且借助POx聚合物臂的可合成性，該策略可適配多種熒光團骨架。

 

參考文獻

Mobley E B, Lin E Y, Sletten E M. Chromenylium star polymers: Merging water solubility and stealth properties with shortwave infrared emissive fluorophores[J]. ACS Central Science, 2024.

 

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