納微快速納米藥物制備系統在制備脂質mRNA-LNP遞送載體中的新應用_abio生物試劑品牌網
近日，浙江大學劉帥課題組使用
納微儀器Nanowetech的NWDPS快速納米藥物制備系統制備單組分陽離子脂質mRNA，靜脈給藥后靶向脾臟T細胞。
NWDPS快速納米藥物制備系統
四組分脂質納米顆粒（LNPs）已被廣泛應用于上市COVID-19 mRNA疫苗和大量mRNA療法的臨床試驗中，證明了它們在將mRNA傳遞到肝臟和肌肉方面的有效性。mRNA藥物的肝外靶向分布對于治療影響非肝器官的多種疾病具有巨大的意義，特別是靶向脾臟和T細胞的特異性mRNA遞送為癌癥免疫治療和誘導抗病毒免疫反應提供了一個引人注目的選擇。
盡管如此，將mRNA靶向遞送至肝外組織在很大程度上仍是限制其應用開發的重要挑戰。目前的脾靶向技術往往以轉染效率或療效降低為代價，導致使用新型遞送載體時，脾中的mRNA整體表達量仍低于肝臟。
2024年4月18日，來自浙江大學藥學院的劉帥課題組在 Angewandte Chemie International Edition上發表了題為 “One-Component Cationic LiPIds for Systemic mRNA Delivery to Splenic T Cells”的研究論文。本研究提出， 富含仲胺的陽離子脂質可以作為獨立的單一組分載體在體外和體內有效地遞送mRNA。此外，這些載體有助于在靜脈給藥后有效地將mRNA遞送至脾臟T細胞亞群，顯示出免疫治療應用的巨大潛力。這種簡單的策略擴展了脂質體在肝外mRNA遞送中的效用，為LNP以外的載體開發提供了新的見解，以進一步推動精準mRNA治療領域的發展。
單組份可電離陽離子脂質載體設計
作為大多數四組分LNP載體的重要組成部分，已有大量研究設計了多種含叔胺的陽離子脂質（An-R-T），通常通過胺基和環氧類似物或丙烯酸酯合成。仔細控制環氧開環和Michael加成起始材料的反應溫度和摩爾比，即可得到富含仲胺基的陽離子脂質（An-R-S）（圖1B、1C），并采用這一設計的可電離陽離子脂質作為單組分載體制備陽離子脂質/mRNA納米顆粒（CLNs）。
圖1. 單組分陽離子脂質載體的設計合成
體外篩選實驗顯示，富仲胺可電離子陽離子脂質（AnEP-S和An-Ac-S）介導了強大的mRNA表達和最小的細胞毒性，最佳候選藥物表現出比叔胺脂質（An-EP-T和An-Ac-T）高4個數量級的遞送效率。與ALC-0315 LNPs相比，效率最佳的TE-EP10-S CLNs顯示了43倍增強。
仲胺脂質CLNs的表征和驗證 在mRNA的結合/包封上，叔胺脂質體僅顯示出低于60%的低mRNA結合率，而單一仲胺脂質的mRNA結合率達到了95%（圖2D）。移液器制備CLN的尺寸相對較大，依靠微流控設備可有效減小粒徑，最佳尺寸維持在100 nm左右。由于An-R-S脂質富含仲胺基和疏水尾部，對mRNA靜電作用和疏水作用保證了CLNs的穩定性，即使在4℃的10%胎牛血清（FBS）血清中孵育7天后，這一設計下的CLNs仍保持穩定（圖2E）。
通過紅細胞破裂測定溶血和通過熒光共振能量轉移（FRET）分析的脂質融合分析，顯示兩種富胺脂質之間的內體逃逸沒有明顯差異（圖2G）。共聚焦熒光成像證實了優化后的仲胺CLNs從內體中有效逃逸（圖2H）。相反，叔胺對應載體由于細胞攝取較低介導了有限的內體逃逸。這些結果突出了單組分可電離陽離子脂質在克服多種遞送障礙方面所取得的突破。此外，基于仲胺的CLN由于增強了mRNA結合和細胞攝取而優于叔胺。
圖2. 單組分陽離子脂質CLN的構效及理化性質分析
研究在C57BL/6小鼠中，通過靜脈注射0.25 mg/kg的劑量，進一步評估了CLNs的器官靶向性（圖3A）。與主要靶向肝臟的LNPs不同，單組分可電離陽離子脂質主要介導靶向脾臟的mRNA表達。
TE-EP8-S具有兩個疏水尾部和五個仲胺基，所得的CLNs在脾臟中獲得了最高的mRNA表達（圖3B）。其介導的熒光素酶表達在脾臟中高出幾個數量級，并呈劑量依賴性增加。
圖3. 單組分CLNs的體內mRNA遞送
引入loxp-Cre重組系統的AI9小鼠模型可以在Cre重組蛋白存在的情況下誘導tdTomato的表達來刪除轉錄終止信號盒（stop cassettes）。實驗表明，裝載Cre mRNA的TE-EP8-S CLNs有效地促進了脾臟中的蛋白表達，在靜脈注射給藥后，近6%的T細胞被轉染（圖4B,C）。
圖4. TE-EP8-Scln介導脾臟T細胞mRNA翻譯
總結
本研究提出的單一組分陽離子脂質直接用于載體構建，為mRNA藥物提供了另一種遞送選擇，并存在將mRNA遞送到肝外組織的潛力。本文提出的基于仲胺的單組分載體方法可以擴展到廣泛的陽離子脂質和聚合物載體，為進一步發展mRNA傳遞技術和應用開啟了新的研究方向。
參考資料
[1]Zhang X, Su K, Wu S, Lin L, He S, Yan X, Shi L, Liu S. One-Component Cationic Lipids for Systemic mRNA Delivery to Splenic T Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 2024 Apr 18:e202405444. doi: 10.1002/anie.202405444.
NWDPS快速納米藥物制備系統
四組分脂質納米顆粒（LNPs）已被廣泛應用于上市COVID-19 mRNA疫苗和大量mRNA療法的臨床試驗中，證明了它們在將mRNA傳遞到肝臟和肌肉方面的有效性。mRNA藥物的肝外靶向分布對于治療影響非肝器官的多種疾病具有巨大的意義，特別是靶向脾臟和T細胞的特異性mRNA遞送為癌癥免疫治療和誘導抗病毒免疫反應提供了一個引人注目的選擇。
盡管如此，將mRNA靶向遞送至肝外組織在很大程度上仍是限制其應用開發的重要挑戰。目前的脾靶向技術往往以轉染效率或療效降低為代價，導致使用新型遞送載體時，脾中的mRNA整體表達量仍低于肝臟。
2024年4月18日，來自浙江大學藥學院的劉帥課題組在 Angewandte Chemie International Edition上發表了題為 “One-Component Cationic LiPIds for Systemic mRNA Delivery to Splenic T Cells”的研究論文。本研究提出， 富含仲胺的陽離子脂質可以作為獨立的單一組分載體在體外和體內有效地遞送mRNA。此外，這些載體有助于在靜脈給藥后有效地將mRNA遞送至脾臟T細胞亞群，顯示出免疫治療應用的巨大潛力。這種簡單的策略擴展了脂質體在肝外mRNA遞送中的效用，為LNP以外的載體開發提供了新的見解，以進一步推動精準mRNA治療領域的發展。
單組份可電離陽離子脂質載體設計
作為大多數四組分LNP載體的重要組成部分，已有大量研究設計了多種含叔胺的陽離子脂質（An-R-T），通常通過胺基和環氧類似物或丙烯酸酯合成。仔細控制環氧開環和Michael加成起始材料的反應溫度和摩爾比，即可得到富含仲胺基的陽離子脂質（An-R-S）（圖1B、1C），并采用這一設計的可電離陽離子脂質作為單組分載體制備陽離子脂質/mRNA納米顆粒（CLNs）。
圖1. 單組分陽離子脂質載體的設計合成
體外篩選實驗顯示，富仲胺可電離子陽離子脂質（AnEP-S和An-Ac-S）介導了強大的mRNA表達和最小的細胞毒性，最佳候選藥物表現出比叔胺脂質（An-EP-T和An-Ac-T）高4個數量級的遞送效率。與ALC-0315 LNPs相比，效率最佳的TE-EP10-S CLNs顯示了43倍增強。
仲胺脂質CLNs的表征和驗證 在mRNA的結合/包封上，叔胺脂質體僅顯示出低于60%的低mRNA結合率，而單一仲胺脂質的mRNA結合率達到了95%（圖2D）。移液器制備CLN的尺寸相對較大，依靠微流控設備可有效減小粒徑，最佳尺寸維持在100 nm左右。由于An-R-S脂質富含仲胺基和疏水尾部，對mRNA靜電作用和疏水作用保證了CLNs的穩定性，即使在4℃的10%胎牛血清（FBS）血清中孵育7天后，這一設計下的CLNs仍保持穩定（圖2E）。
通過紅細胞破裂測定溶血和通過熒光共振能量轉移（FRET）分析的脂質融合分析，顯示兩種富胺脂質之間的內體逃逸沒有明顯差異（圖2G）。共聚焦熒光成像證實了優化后的仲胺CLNs從內體中有效逃逸（圖2H）。相反，叔胺對應載體由于細胞攝取較低介導了有限的內體逃逸。這些結果突出了單組分可電離陽離子脂質在克服多種遞送障礙方面所取得的突破。此外，基于仲胺的CLN由于增強了mRNA結合和細胞攝取而優于叔胺。
圖2. 單組分陽離子脂質CLN的構效及理化性質分析
研究在C57BL/6小鼠中，通過靜脈注射0.25 mg/kg的劑量，進一步評估了CLNs的器官靶向性（圖3A）。與主要靶向肝臟的LNPs不同，單組分可電離陽離子脂質主要介導靶向脾臟的mRNA表達。
TE-EP8-S具有兩個疏水尾部和五個仲胺基，所得的CLNs在脾臟中獲得了最高的mRNA表達（圖3B）。其介導的熒光素酶表達在脾臟中高出幾個數量級，并呈劑量依賴性增加。
圖3. 單組分CLNs的體內mRNA遞送
引入loxp-Cre重組系統的AI9小鼠模型可以在Cre重組蛋白存在的情況下誘導tdTomato的表達來刪除轉錄終止信號盒（stop cassettes）。實驗表明，裝載Cre mRNA的TE-EP8-S CLNs有效地促進了脾臟中的蛋白表達，在靜脈注射給藥后，近6%的T細胞被轉染（圖4B,C）。
圖4. TE-EP8-Scln介導脾臟T細胞mRNA翻譯
總結
本研究提出的單一組分陽離子脂質直接用于載體構建，為mRNA藥物提供了另一種遞送選擇，并存在將mRNA遞送到肝外組織的潛力。本文提出的基于仲胺的單組分載體方法可以擴展到廣泛的陽離子脂質和聚合物載體，為進一步發展mRNA傳遞技術和應用開啟了新的研究方向。
參考資料
[1]Zhang X, Su K, Wu S, Lin L, He S, Yan X, Shi L, Liu S. One-Component Cationic Lipids for Systemic mRNA Delivery to Splenic T Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 2024 Apr 18:e202405444. doi: 10.1002/anie.202405444.
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