從理想到現(xiàn)實(shí)：一個(gè)追光者的STED使用史?

李曉明（上海科技大學(xué)）

科學(xué)和技術(shù)的關(guān)系是科學(xué)史專家們喜歡討論的課題，它們互相融合、互相促進(jìn)、互相激發(fā)，一起促進(jìn)了社會(huì)的進(jìn)步。傳統(tǒng)的科學(xué)史專家偏向認(rèn)為科學(xué)發(fā)展是范式轉(zhuǎn)換，經(jīng)常由深刻的創(chuàng)新思想驅(qū)動(dòng)^[1]；而近百年或者近五十年來的科技發(fā)展也表現(xiàn)出另外一種態(tài)勢(shì)，即新技術(shù)打開新的研究領(lǐng)域或新的研究維度。光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展便是其中一個(gè)典型案例，這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)的進(jìn)步并非是基礎(chǔ)的哲學(xué)、數(shù)學(xué)或物理學(xué)上的重大理論突破，而是利用已有理論提高人類研究在空間和時(shí)間的分辨率、拓寬研究組分的類別，從而構(gòu)建出可研究的微觀新時(shí)空。

科學(xué)家（使用者）們對(duì)科技的的需求是多元化的，最理想的技術(shù)是可以同時(shí)檢測(cè)所有感興趣組分隨在各個(gè)時(shí)空維度上、各種尺度上的動(dòng)態(tài)變化。另一方面，技術(shù)研發(fā)者們希望展現(xiàn)他們的技術(shù)在某個(gè)維度上的極致展現(xiàn)，這需要將技術(shù)局限在某個(gè)特定時(shí)空維度上來展現(xiàn)有限且特定的組分變化。

2009年Nature Milestones歷數(shù)了光學(xué)成像領(lǐng)域從1595年到2006年的技術(shù)里程碑，敘述了顯微成像技術(shù)和標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，展現(xiàn)了技術(shù)和需求的碰撞一步步推動(dòng)了科學(xué)家們探索多種目標(biāo)組分在多維度時(shí)空的分布和變化的發(fā)展史，將自然科學(xué)的研究引入了新的時(shí)空^[2]。而我們也看到了這些技術(shù)對(duì)科學(xué)特別是生命科學(xué)的進(jìn)步起到了極大的推動(dòng)作用，很多技術(shù)應(yīng)用至今仍然不可或缺。同所有在后來發(fā)揚(yáng)光大的那些技術(shù)一樣，受激發(fā)射損耗顯微鏡（Stimulated Emission Depletion，STED）超高分辨率成像技術(shù)也在研發(fā)者和使用者的拉扯中經(jīng)歷了從理想到現(xiàn)實(shí)的歷程。

STED 的發(fā)明
超高分辨帶來超高理想

極限就是用來打破的。當(dāng)阿貝提出分辨極限以后^[3]，成像科學(xué)家們就希望發(fā)展從多角度切入以突破光學(xué)衍射極限，上世紀(jì)九十年代前后涌現(xiàn)出多種超高分辨率顯微成像技術(shù)，將基于光學(xué)成像技術(shù)的科學(xué)研究慢慢帶進(jìn)了納米尺度空間。其中，1994年Stefan Hell就發(fā)文章闡述了使用受激輻射技術(shù)來突破分辨率的理論和STED顯微鏡搭建理論^[4]，2001年便報(bào)道了使用不同形狀的受激幅射光來突破分辨率極限的STED顯微鏡^[5]。這項(xiàng)技術(shù)的突破給科研工作者們提供了更高維度的研究可能，獲得了2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。而STED超高分辨率成像技術(shù)也開始了20年來的打怪升級(jí)，從給科學(xué)家們帶來眾多科研想法和可能性的研究成果慢慢進(jìn)化成易用、穩(wěn)定的成熟商業(yè)產(chǎn)品。我們可以看到這項(xiàng)技術(shù)從理想到現(xiàn)實(shí)、從單維度到多維度的蛻變，STED成像技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域越來越多，解決的問題越來越復(fù)雜。

SP5 時(shí)代
從單色STED到多色STED

STED走進(jìn)市場(chǎng)是2007年SP5時(shí)代的TCS STED，我第一次接觸已經(jīng)是幾年后的TCS STED CW了。那時(shí)候只有雙光子和氬離子激光器作為激發(fā)光的Pulsed STED和CW STED，受激輻射光好像也只有592nm的激光。現(xiàn)在回頭看，那時(shí)候的技術(shù)只能做折射率適合、592nm光吸收低、標(biāo)記信號(hào)極亮的、激發(fā)光為458-514nm之間的熒光樣品成像，而這時(shí)候商業(yè)化產(chǎn)品的官方宣稱分辨率只有80nm。

那時(shí)候大家試圖在百納米分辨率以內(nèi)研究細(xì)胞組分的相互作用的話，只能選擇類似BD Horizon V500和Alexa 488這種極易串色的染料組合，那時(shí)候的protocol里甚至還有串色拆分的教程。但是有和無的差別，已經(jīng)很震撼了，至少研究者們可以嘗試在百納米光學(xué)分辨率的空間里進(jìn)行分析研究了。

圖1. 早期雙色STED的protocol

2010年前后，隨著STED染料的研發(fā)、脈沖白激光的使用和受激輻射激光的選擇變多，研究者們發(fā)現(xiàn)使用750nm波長(zhǎng)的激光器可以對(duì)ATTO 647N和 ATTO 655等紅外熒光染料進(jìn)行更有效的光損耗，而且在592nm受激輻射光成像時(shí)由樣品或封片劑等原因造成的信號(hào)模糊也明顯減輕了。一方面研究者們可以選擇成像效果更好的紅外染料進(jìn)行單色STED，也可以使用750nm和592nm受激輻射光的聯(lián)用來實(shí)現(xiàn)2-3個(gè)通道的STED成像了。

SP8 時(shí)代
對(duì)生物用戶使用門檻降低的STED

2016年我的身份由方法學(xué)科研工作者轉(zhuǎn)變?yōu)槠脚_(tái)技術(shù)人員，這時(shí)期的STED也在前一年進(jìn)入了SP8平臺(tái)時(shí)代，生物用戶們發(fā)現(xiàn)基于SP8的STED越來越容易上手了。2014年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)讓領(lǐng)域的科研工作者們了解了STED等超高分辨率顯微鏡技術(shù)，而經(jīng)過十年的發(fā)展這時(shí)候基于白激光+HyD檢測(cè)器的SP8新平臺(tái)已經(jīng)非常成熟，推出了很多項(xiàng)對(duì)生物用戶友好的商業(yè)化技術(shù)。

首先讓人印象深刻的就是Gated CW-STED (gSTED)了，gSTED 使用更低的STED激光強(qiáng)度達(dá)到了比CW STED更好的分辨率，同時(shí)使用基于熒光壽命的時(shí)間門控技術(shù)用戶可以輕松地去掉592nm受激幅射光帶來的一些信號(hào)損失和模糊，這時(shí)候STED的分辨率提升到現(xiàn)在大家熟知的50nm。gSTED技術(shù)讓生物用戶可以使用非常熟悉的EGFP、AF488、mCherry等染料或熒光蛋白進(jìn)行STED成像。雖然很多常用成像探針無法將STED效果發(fā)揮到極致，但是對(duì)于生物學(xué)家而言，他們更偏向于不必?fù)Q實(shí)驗(yàn)體系就能實(shí)現(xiàn)研究目的。這是熒光壽命技術(shù)最初在STED商業(yè)化產(chǎn)品中的應(yīng)用，最近幾年這個(gè)領(lǐng)域又有很多進(jìn)展，一直持續(xù)不斷給使用者們帶來驚喜。

圖2. gSTED對(duì)成像效果的改善

2016年我們單位購置了第一臺(tái)受激發(fā)射耗損顯微術(shù)，型號(hào)是TCS SP8 STED 3X。這時(shí)候紅外熒光染料對(duì)應(yīng)的受激幅射光已經(jīng)從750nm的連續(xù)激光升級(jí)成了775nm的脈沖激光，我們發(fā)現(xiàn)775nm的STED成像分辨率遠(yuǎn)高于以前的任何波長(zhǎng)的受激幅射光，在普通生物樣品中最佳分辨率竟然可以達(dá)到30-40nm。更神奇的是775nm的受激幅射光不再有連續(xù)受激輻射激光“一掃沒”的現(xiàn)象（592/660nm連續(xù)激光掃過樣品一次以后很多常見熒光探針淬滅現(xiàn)象嚴(yán)重，俗稱“一掃沒”），我們甚至可以使用775nm的STED成像模式進(jìn)行預(yù)覽來找到更合適的拍攝位置、甚至還可以進(jìn)行多層Z STACK掃描、甚至還可以做點(diǎn)活細(xì)胞STED成像。與之對(duì)應(yīng)的是，這時(shí)候受激幅射光的形狀調(diào)制也引入了新方法，除了在xy維度上可以提升分辨率，z軸維度上也可以使用3D STED技術(shù)來提高分辨率了。

至此，對(duì)普通生物用戶而言，如果使用775nm友好的紅色和紅外染料，這時(shí)的雙通道STED成像和常規(guī)共聚焦一樣簡(jiǎn)單了；這些染料和gSTED聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)更多通道的STED成像。而最近幾年熒光染料的發(fā)展涌現(xiàn)了很多l(xiāng)ong stoke位移的熒光染料，比如abberior STAR 460L、abberior STAR 520L等，也可以使用775nm的脈沖激光作為受激幅射光進(jìn)行3-5色的STED成像。這些成像和制樣技術(shù)的進(jìn)步使得制樣難度大大降低。而同一時(shí)期，我們也開始了從純化染色質(zhì)到細(xì)菌、細(xì)胞、腦片、線蟲和完整果蠅腦等較廣泛生物樣品的STED成像^[6-9]。

圖3. STED在線蟲過氧化物酶體中的應(yīng)用

STELLARIS 時(shí)代
光毒性更小、通道更多

雖然基于熒光壽命的STED性能提升在SP8時(shí)代已經(jīng)開啟，但是真正作為獨(dú)立實(shí)用工具的推出是在2020年前后的STELLARIS平臺(tái)。在gSTED通過簡(jiǎn)單設(shè)置hyD檢測(cè)器門控時(shí)間的基礎(chǔ)上，研究者們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化FLIM數(shù)據(jù)的分析可以進(jìn)一步地提高STED的成像分辨率。在熒光光子數(shù)和分辨率平衡的基礎(chǔ)上，F(xiàn)LIM-STED達(dá)到相應(yīng)的分辨率只需要使用傳統(tǒng)STED 1/3到1/4的損耗光強(qiáng)度來成像便可達(dá)到常規(guī)STED的成像效果。因此，這種TauSTED技術(shù)可以在較厚樣品成像中對(duì)z軸采集更多層的信號(hào)，也可以在活細(xì)胞成像中采集更多幀數(shù)，進(jìn)一步拓寬了成像應(yīng)用范圍。

與之相應(yīng)的，不同STED顯微鏡廠家也改進(jìn)了STED技術(shù)在厚樣品成像中應(yīng)用，使用更適合生物樣品折射率的甘油物鏡、硅油物鏡或者水鏡以及特別的照明方式，讓使用者更容易對(duì)樣品較深的位置進(jìn)行STED成像或者進(jìn)行更厚的信號(hào)采集。2023年，有實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了使用硅油物鏡對(duì)19.3x15x6 μm3的較厚活腦片進(jìn)行xyzt 4維成像，為光學(xué)成像技術(shù)在突觸分辨率水平對(duì)活體大腦組織進(jìn)行動(dòng)態(tài)功能研究打開了新的研究途徑^[10]。

圖4. 3D STED技術(shù)在信號(hào)密集的活體厚腦片成像中的應(yīng)用

除此之外，基于熒光壽命光譜拆分的成像方法最近二十年也一直是成像領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。早在2017年Hell團(tuán)隊(duì)就報(bào)道了使用612 nm的激發(fā)光和 775 nm的受激幅射光對(duì)ATTO 594、Abberior STAR 635P、KK1441、CF680R標(biāo)記的樣品進(jìn)行STED成像并進(jìn)行光譜拆分得到多通道成像結(jié)果的方法^[11]。隨著近幾年光譜向量拆分技術(shù)的成熟，使得這個(gè)方法對(duì)不同通道信號(hào)亮度的差異越來越寬容，常規(guī)生物樣品即可進(jìn)行5-6色的拆分^[12]。

圖5. 基于向量拆分的5色STED成像

STED 標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展

除了儀器的進(jìn)步之外，標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步也在推動(dòng)著STED成像技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用^[13]。理想的STED熒光探針應(yīng)該在受激輻射成像區(qū)域內(nèi)完全耗盡且盡量低的產(chǎn)生噪聲，亦不需要使用太強(qiáng)的受激輻射激光，從而提高STED的分辨率并減少 STED 帶來的光漂白，因此熒光探針的理化性質(zhì)對(duì)STED在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用影響巨大。最初的STED應(yīng)用中，研究者們主要篩選適合進(jìn)行STED成像的傳統(tǒng)熒光染料或熒光蛋白，主要有BD Horizon V500、NBD-X、Alexa 488、eYFP等。

很快大家發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)熒光探針在實(shí)際應(yīng)用中遇到一些挑戰(zhàn)，需要從以下幾點(diǎn)來開發(fā)更適合STED成像的熒光探針：

1、提高光穩(wěn)定性。
2、提高STED損耗效率。
3、降低受激輻射損耗背景噪音。
4、提高生物相容性。
5、減少受激幅射光對(duì)其他熒光探針的淬滅。
6、降低標(biāo)記方法帶來的定位精度偏差。

基于這些需求，研究者們開發(fā)出了STED友好的熒光蛋白 (iRFP、TagRFP657、mNeptune2、mGarnet2等)、STED友好的有機(jī)染料（Star家族、SiR等，可連接到抗體上也可以用HaloTag 或SNAPTag靶向到活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)）、避免被592nm或660nm強(qiáng)激光漂白的long stoke位移的熒光染料和標(biāo)記物和目標(biāo)區(qū)域距離更小的納米抗體等，使得STED技術(shù)更加廣泛地應(yīng)用到生物研究中。

總結(jié)和展望

作為一種對(duì)圖像重構(gòu)技術(shù)依賴較小、且樣品制備相對(duì)簡(jiǎn)單的納米顯微成像技術(shù)，STED得到了很多生物學(xué)研究者們的青睞，在二十多年的技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用中不斷迭代，應(yīng)用到越來越多的領(lǐng)域，也取得了很多成就，為推動(dòng)生命科學(xué)研究在納米空間拓展做出了很多的貢獻(xiàn)。

但是由于受激輻射相關(guān)的分辨率提高技術(shù)對(duì)熒光分子標(biāo)記密度和均勻性要求較高，在分辨率極限附近我們經(jīng)常需要使用電鏡等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。而在活細(xì)胞或厚樣品成像中，光毒性和光淬滅依然是需要進(jìn)一步解決的問題，這有賴于成像技術(shù)、標(biāo)記探針和制樣方法等多方面的進(jìn)步。技術(shù)在現(xiàn)實(shí)領(lǐng)域中推廣時(shí)總是會(huì)遇到復(fù)雜維度的需求，期待STED技術(shù)在現(xiàn)實(shí)樣品應(yīng)用中帶來更多貢獻(xiàn)。

免費(fèi)預(yù)約STED樣機(jī)演示

參考文獻(xiàn)：
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STELLARIS STED

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