在現代生物醫學研究中，獲取高質量的三維結構和功能信息對于深入理解生物系統的復雜性至關重要。光學顯微鏡技術作為獲取這些信息的關鍵工具，一直在不斷地發展和創新。然而，生物組織的復雜性和光學成像的物理限制，使得三維成像面臨諸多挑戰?，F基于最新研究文獻，對光學切片技術在三維生物成像中的應用進行深入解讀，探討其技術創新、實驗結果以及未來發展方向。

研究背景與技術挑戰
光學顯微鏡在生物成像領域具有不可替代的地位，它能夠提供亞微米級分辨率的三維結構和功能信息。然而，生物組織的復雜性給三維成像帶來了諸多挑戰。首先，生物組織中的強烈散射效應會導致成像質量下降，使得遠離焦點的熒光背景信號干擾成像。其次，成像技術還面臨時空分辨率有限、信噪比低、穿透深度不足以及光毒性高等問題。例如，共聚焦顯微鏡雖然在固定細胞成像中被廣泛使用，但其高光毒性和有限的穿透深度限制了其在活體成像中的應用。而非線性顯微鏡雖然具有更好的穿透深度，但其時空分辨率較低，難以滿足對復雜生物組織進行快速、高分辨率成像的需求。此外，隨著成像深度的增加，散射效應會進一步增強，導致成像質量急劇下降，這也成為厚組織成像的主要障礙之一。

技術創新與應用
共軸成像技術
共軸成像技術中，照明和檢測軸重合，導致焦點內外信號高度混合。其中，共聚焦顯微鏡是最常用的光學切片方法之一，通過在檢測器前設置針孔來阻擋離焦信號，從而實現光學切片。然而，共聚焦顯微鏡的成像速度和穿透深度有限。為了提高成像速度，多焦點并行掃描技術被提出，通過空間光調制器或微透鏡陣列生成掃描網格，實現多點同時激發和檢測。此外，線共聚焦顯微鏡采用線掃描代替點掃描，大幅提高了成像通量，但以降低光學切片能力為代價。多光子顯微鏡則利用非線性效應，在焦點處選擇性激發信號，實現深組織成像，但其成像速度較慢，且對樣品的光漂白較為嚴重。

非共軸成像技術
非共軸成像技術通過分離照明和檢測軸，避免了共軸成像中的焦點內外信號混合問題。光片顯微鏡是典型的非共軸成像技術，通過垂直照明和檢測實現光學切片，具有低光毒性和高成像速率的優點，適用于胚胎發育等領域的活體成像。然而，光片顯微鏡在厚樣品成像中，由于散射效應的影響，成像質量會有所下降。線照明調制顯微鏡（LiMo）等單掃描光學切片顯微鏡的出現，為厚組織成像提供了新的解決方案。這些方法通過線掃描成像和后期重建算法，實現了速度與光學切片能力的平衡，即使在器官水平也能獲得可接受的成像質量。

成像實驗與結果分析
共軸成像技術實驗
在共聚焦顯微鏡實驗中，使用固定細胞樣品進行成像，結果顯示共聚焦顯微鏡能夠有效提高成像分辨率和光學切片能力，但在厚樣品成像中，其穿透深度和成像速度的不足逐漸顯現。多光子顯微鏡實驗中，對活體動物大腦進行成像，成功觀察到了單個細胞的生物活動，如鈣成像等，驗證了其在深組織成像中的優勢。然而，多光子顯微鏡的成像速度較慢，限制了其對快速動態過程的捕捉能力。

性能比較與分析
通過對不同技術的實驗結果進行比較分析，發現共軸成像技術在薄樣品成像中具有較高的分辨率和光學切片能力，但在厚樣品成像中受到限制。而非共軸成像技術則在厚樣品成像中表現出更好的適應性，能夠有效抑制背景信號，提高成像質量。光片顯微鏡和LiMo顯微鏡等非共軸技術在成像速度和光毒性方面具有明顯優勢，適用于活體成像和大型樣品成像。此外，不同技術在信噪比、成像深度、光安全性和后處理速度等方面也存在差異，這些因素需要根據具體的成像需求進行綜合考慮，以選擇最適合的成像技術。

總結與展望
光學切片技術在三維生物成像中發揮著至關重要的作用，為生物醫學研究提供了強大的工具。共軸和非共軸成像技術各具特色，適用于不同的成像場景和需求。共軸成像技術如共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡，在高分辨率和深組織成像方面具有優勢，但受限于成像速度和光毒性等問題。非共軸成像技術如光片顯微鏡和LiMo顯微鏡，則以其低光毒性和高成像速率，在活體成像和大型樣品成像中展現出獨特魅力，同時通過技術創新不斷克服散射等成像障礙。隨著技術的不斷進步和創新，光學切片技術將朝著更高分辨率、更深穿透深度、更低光毒性和更快成像速度的方向發展。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。

Zhang, J., Qiao, W., Jin, R. et al. Optical sectioning methods in three-dimensional bioimaging. Light Sci Appl 14, 11 (2025). 

DOI:org/10.1038/s41377-024-01677-x.