貓冠狀病毒S蛋白（SPIke 蛋白，刺突蛋白）是病毒包膜表面的關鍵結構蛋白，負責識別宿主細胞受體并介導病毒入侵，其構象和功能依賴于復雜的翻譯后修飾（如糖基化），因此真核表達系統是獲取具有天然活性 S 蛋白的主要手段。以下從結構、真核表達系統選擇、蛋白分子量及制備流程等方面詳細介紹：

貓冠狀病毒（FCoV）的 S 蛋白是一種 Ⅰ 型跨膜糖蛋白，整體結構分為三個功能區：

• 胞外區：包含受體結合域（RBD）和融合肽（FP），RBD 可特異性結合宿主細胞表面的氨肽酶 N（APN）受體，是病毒入侵的關鍵識別位點；融合肽在病毒與宿主細胞膜接觸后介導膜融合。
• 跨膜區：錨定 S 蛋白于病毒包膜或感染細胞的細胞膜上。
• 胞內區：較短，可能參與病毒組裝過程中的信號傳遞。

S 蛋白在天然狀態下以同源三聚體形式存在，且需經過糖基化修飾（約含 20-30 個 N - 糖基化位點），這些修飾對維持蛋白構象、受體結合能力及免疫原性至關重要。

由于 S 蛋白需要復雜的糖基化修飾和正確的三聚體折疊，原核表達系統（如大腸桿菌）無法滿足需求，因此必須采用真核表達系統。常用系統及其特點如下：

1. 昆蟲細胞 - 桿狀病毒系統（BEVS）

   • 優勢：可高效表達大分子量蛋白，糖基化修飾接近哺乳動物細胞（雖略簡單，但足以支持 S 蛋白的基本功能），且易于大規模培養。
   • 應用：常用于制備 S 蛋白三聚體，用于受體結合實驗或疫苗候選抗原。

2. 哺乳動物細胞系統

   • 常用細胞：HEK293（人胚腎細胞）、CHO（中國倉鼠卵巢細胞）。
   • 優勢：糖基化修飾最接近天然病毒 S 蛋白，能準確折疊形成功能性三聚體，適合研究蛋白的天然構象和免疫原性。
   • 不足：表達量相對較低，成本較高，適合小批量、高活性的 S 蛋白制備。

3. 酵母系統（如畢赤酵母）

   • 優勢：操作簡便、成本低，可實現高密度發酵。
   • 局限性：糖基化修飾與哺乳動物差異較大（高甘露糖型），可能影響 S 蛋白的受體結合或免疫原性，應用較少。

天然 S 蛋白的分子量因糖基化修飾程度而異：

• 未糖基化的 S 蛋白前體（單體）分子量約為180-200 kDa（由約 1400-1500 個氨基酸組成）。
• 經真核系統表達并糖基化后，單體分子量增至200-250 kDa；三聚體分子量約為600-750 kDa。

1. 基因優化與載體構建

   • 從 FCoV 毒株中克隆 S 蛋白全長或功能片段（如 RBD、三聚體穩定型 S 蛋白）的基因，根據表達宿主（如 HEK293）進行密碼子優化，以提高表達效率。
   • 將基因插入真核表達載體（如 pcDNA3.1），載體需含信號肽（引導蛋白分泌至細胞外）、標簽（如 His-tag、Fc-tag，便于純化）及啟動子（如 CMV 啟動子）。

2. 細胞轉染與表達篩選

   • 采用脂質體或電穿孔法將重組載體轉染至哺乳動物細胞（如 HEK293F 懸浮細胞），通過抗性篩選獲得穩定表達株（或瞬時表達）。
   • 優化培養條件（溫度 37℃、CO?濃度 5%），收集細胞上清（分泌型表達）或細胞裂解液（胞內表達），通過 Western blot 檢測 S 蛋白表達情況。

3. 蛋白純化

   • 基于標簽進行親和層析：如 His-tag 蛋白用 Ni2?-NTA 柱，Fc-tag 蛋白用 Protein A/G 柱。
   • 進一步純化：通過離子交換層析、凝膠過濾層析去除雜蛋白，獲得高純度 S 蛋白。
   • 三聚體純化：若目標為功能性三聚體，可利用凝膠過濾層析分離單體與三聚體組分（三聚體分子量更大，出峰更早）。

4. 活性鑒定

   • 構象驗證：通過圓二色譜（CD）或低溫電鏡分析蛋白折疊狀態。
   • 功能驗證：采用受體結合實驗（如 ELISA 檢測與 APN 受體的結合能力）或假病毒中和實驗（評估其誘導中和抗體的潛力）。

1. 病毒入侵機制研究：通過真核表達的 S 蛋白，解析其與宿主受體（APN）的相互作用，揭示 FCoV 的感染機制。
2. 診斷試劑開發：以 S 蛋白（尤其是 RBD）為抗原，檢測貓血清中的中和抗體，評估感染或免疫狀態（中和抗體可反映對病毒的保護力）。
3. 疫苗研發：S 蛋白是誘導中和抗體的關鍵靶標，真核表達的功能性 S 蛋白（如三聚體）是亞單位疫苗的核心成分，可激發宿主產生保護性免疫應答。

貓冠狀病毒 S 真核蛋白的制備依賴于能提供復雜糖基化修飾的真核表達系統（如哺乳動物細胞或昆蟲細胞），其天然構象和功能對病毒入侵機制研究、診斷及疫苗開發至關重要。相較于原核表達，真核系統雖成本較高，但能保證 S 蛋白的生物學活性，是相關應用的首選方案。