新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）的 HN 蛋白（Hemagglutinin-Neuraminidase Protein，血凝素 - 神經(jīng)氨酸酶蛋白）是病毒包膜上另一種關(guān)鍵糖蛋白，與 F 蛋白協(xié)同介導(dǎo)病毒入侵，并具有獨(dú)立的免疫原性。以下從結(jié)構(gòu)功能、真核表達(dá)特點(diǎn)及應(yīng)用等方面，詳細(xì)介紹新城疫 HN 真核蛋白：

一、NDV HN 蛋白的結(jié)構(gòu)與核心功能
HN 蛋白是 NDV 表面含量最高的膜蛋白，兼具血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）活性，在病毒感染周期和免疫應(yīng)答中發(fā)揮多重作用：
1.  結(jié)構(gòu)特征

• 整體結(jié)構(gòu)：HN 蛋白以同源四聚體形式存在（由 4 個(gè)相同亞基組成），每個(gè)亞基分子量約 75-80 kDa，含胞外區(qū)（占 90% 以上）、跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾。胞外區(qū)是功能核心，包含血凝素、神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)及抗原表位。
• 關(guān)鍵功能域： 
  • 受體結(jié)合位點(diǎn)：位于胞外區(qū)頂端，可特異性識(shí)別宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體（如禽類呼吸道和消化道上皮細(xì)胞的糖蛋白 / 糖脂），介導(dǎo)病毒吸附。
  • 神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)：催化唾液酸從糖鏈上水解，其功能包括：① 促進(jìn)病毒從感染細(xì)胞釋放（避免子代病毒聚集）；② 協(xié)助病毒穿透宿主黏液層（黏液中含大量唾液酸，可 “捕獲” 病毒）；③ 調(diào)節(jié)受體結(jié)合親和力，避免病毒過(guò)度吸附于已感染細(xì)胞。
  • 與 F 蛋白相互作用的區(qū)域：HN 蛋白通過(guò)特定位點(diǎn)（如某些保守氨基酸殘基）與 F 蛋白結(jié)合，觸發(fā) F 蛋白構(gòu)象變化，間接激活 F 蛋白的膜融合功能（無(wú) HN 蛋白時(shí)，F(xiàn) 蛋白無(wú)法有效介導(dǎo)融合）。
  • 抗原表位：胞外區(qū)含多個(gè)線性和構(gòu)象型抗原表位，其中部分表位可誘導(dǎo)中和抗體，或作為 T 細(xì)胞識(shí)別的抗原位點(diǎn)。

2.  核心生物學(xué)功能

• 病毒吸附與釋放：通過(guò)血凝素活性結(jié)合宿主細(xì)胞受體，啟動(dòng)感染；通過(guò)神經(jīng)氨酸酶活性水解受體，幫助子代病毒脫離感染細(xì)胞，擴(kuò)散至新細(xì)胞。
• 輔助膜融合：與 F 蛋白相互作用，為 F 蛋白提供 “活化信號(hào)”，使其從無(wú)活性構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榭山閷?dǎo)膜融合的活性構(gòu)象（F 蛋白單獨(dú)存在時(shí)無(wú)法完成融合）。
• 免疫原性：雖誘導(dǎo)中和抗體的能力弱于 F 蛋白，但仍是重要的免疫原，其抗體可通過(guò)阻斷病毒吸附（抗血凝素活性）或抑制釋放（抗神經(jīng)氨酸酶活性）發(fā)揮保護(hù)作用；同時(shí)，HN 蛋白可激活 T 細(xì)胞免疫，參與清除感染細(xì)胞。

二、HN 真核蛋白的表達(dá)優(yōu)勢(shì)與系統(tǒng)選擇

HN 蛋白的功能依賴于正確的糖基化修飾、四聚體組裝及構(gòu)象完整性（如受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原表位的空間結(jié)構(gòu)），原核表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌）無(wú)法實(shí)現(xiàn)這些加工，表達(dá)產(chǎn)物多為無(wú)活性的單體或錯(cuò)誤折疊形式。真核表達(dá)系統(tǒng)因具備完善的蛋白修飾和組裝機(jī)制，成為 HN 蛋白表達(dá)的理想選擇：

1.  真核表達(dá)的核心優(yōu)勢(shì)

• 正確糖基化修飾：HN 蛋白含多個(gè) N - 糖基化位點(diǎn)，糖基化不僅影響其穩(wěn)定性，還參與受體結(jié)合和抗原表位形成。真核細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞）可模擬病毒天然的糖基化模式（如唾液酸化、巖藻糖化），確保蛋白功能正常。
• 四聚體組裝：HN 蛋白需形成四聚體才具有完整的血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng) - 高爾基體系統(tǒng)可輔助亞基正確組裝，維持多聚體結(jié)構(gòu)。
• 構(gòu)象完整性：真核表達(dá)的 HN 蛋白可折疊為天然構(gòu)象，保留受體結(jié)合位點(diǎn)、與 F 蛋白相互作用的區(qū)域及構(gòu)象型抗原表位，確保其生物學(xué)活性和免疫原性。

2.  常用真核表達(dá)系統(tǒng)

• 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)（如 HEK293、Vero）： 
  • 優(yōu)勢(shì)：糖基化修飾最接近天然 NDV HN 蛋白（尤其是禽類來(lái)源細(xì)胞，如 DF-1 雞成纖維細(xì)胞），四聚體組裝效率高，適合研究 HN 蛋白與宿主受體的相互作用或制備高活性抗原。
  • 局限：表達(dá)量較低（微克級(jí) / 升），成本較高，適合小批量、高活性需求的場(chǎng)景（如機(jī)制研究）。
• 昆蟲細(xì)胞 - 桿狀病毒系統(tǒng)（BEVS）： 
  • 優(yōu)勢(shì)：表達(dá)量高（毫克級(jí) / 升），可高效分泌可溶性 HN 蛋白（或膜結(jié)合形式），四聚體組裝能力強(qiáng)，且糖基化修飾雖與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有差異（如高甘露糖型），但對(duì) HN 蛋白的酶活性和抗原性影響較小。
  • 應(yīng)用：是大規(guī)模制備 HN 蛋白的首選系統(tǒng)，適合亞單位疫苗、診斷試劑的工業(yè)化生產(chǎn)。
• 酵母表達(dá)系統(tǒng)（如畢赤酵母）： 
  • 優(yōu)勢(shì)：成本低、培養(yǎng)簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，表達(dá)量高（毫克級(jí) / 升），且能對(duì)蛋白進(jìn)行糖基化修飾（雖與天然模式有差異，但可通過(guò)基因工程改造優(yōu)化）。
  • 局限：四聚體組裝效率略低于昆蟲細(xì)胞，部分構(gòu)象型表位可能受影響，適合對(duì)活性要求稍低的場(chǎng)景（如診斷抗原）。

三、HN 真核蛋白的表達(dá)流程（以昆蟲細(xì)胞為例）

1. 基因優(yōu)化與載體構(gòu)建：

   • 克隆 NDV HN 基因（全長(zhǎng)或胞外區(qū)片段，胞外區(qū)更易可溶性表達(dá)），根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子偏好性優(yōu)化序列（如調(diào)整密碼子使用頻率），提升表達(dá)效率。
   • 構(gòu)建重組載體：將 HN 基因插入桿狀病毒表達(dá)載體（如 pFastBac?），可在 C 端添加 His-tag、Strep-tag 等標(biāo)簽（便于純化），同時(shí)保留信號(hào)肽以促進(jìn)分泌表達(dá)。

2. 重組病毒制備與蛋白表達(dá)：

   • 轉(zhuǎn)化含 Bacmid 的大腸桿菌，獲得重組 Bacmid 后轉(zhuǎn)染 Sf9 或 Sf21 昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增重組桿狀病毒。
   • 用重組病毒感染對(duì)數(shù)期昆蟲細(xì)胞（MOI=2-5），培養(yǎng) 72-96 小時(shí)，HN 蛋白可分泌至上清（胞外區(qū)片段）或錨定于細(xì)胞膜（全長(zhǎng)蛋白）。

3. 蛋白純化與活性驗(yàn)證：

   • 純化：通過(guò)親和層析（如鎳柱結(jié)合 His-tag）純化上清中的可溶性 HN 蛋白，結(jié)合凝膠過(guò)濾層析去除聚合體或單體雜質(zhì)，獲得四聚體純品（純度 > 90%）。
   • 驗(yàn)證： 
     • 結(jié)構(gòu)驗(yàn)證：SDS-PAGE 檢測(cè)分子量（還原條件下為單體，非還原條件下可見(jiàn)四聚體），Western blot 用抗 HN 單抗確認(rèn)特異性。
     • 功能驗(yàn)證： 
       • 血凝試驗(yàn)：檢測(cè)其與雞紅細(xì)胞的凝集能力（血凝素活性），并可被特異性抗體抑制（血凝抑制試驗(yàn)）。
       • 神經(jīng)氨酸酶活性試驗(yàn)：通過(guò)熒光底物或比色法檢測(cè)其水解唾液酸的能力。
       • 抗原性驗(yàn)證：ELISA 檢測(cè)與 NDV 陽(yáng)性血清的結(jié)合能力，評(píng)估構(gòu)象型表位完整性。

四、HN 真核蛋白的應(yīng)用

1. 亞單位疫苗研發(fā)：

   • 作為聯(lián)合抗原：與 F 蛋白協(xié)同使用（如 “F+HN” 混合疫苗），可誘導(dǎo)更全面的免疫應(yīng)答（F 蛋白主要誘導(dǎo)中和抗體，HN 蛋白輔助增強(qiáng)抗體水平和細(xì)胞免疫），提升保護(hù)效力。
   • 新型疫苗載體：將 HN 蛋白與其他病原抗原（如禽流感 HA 蛋白）融合表達(dá)，利用其免疫原性和靶向性，開(kāi)發(fā)多聯(lián)疫苗。

2. 診斷試劑開(kāi)發(fā)：

   • 抗體檢測(cè)：作為 ELISA 或血凝抑制試驗(yàn)的抗原，檢測(cè)禽類血清中的 NDV 抗體，用于評(píng)估疫苗免疫效果或流行病學(xué)調(diào)查。真核表達(dá)的 HN 蛋白因保留天然構(gòu)象，檢測(cè)特異性和靈敏度顯著高于原核蛋白。
   • 病毒檢測(cè)：制備抗 HN 蛋白單克隆抗體，開(kāi)發(fā)免疫熒光、膠體金試紙條等試劑，快速檢測(cè)樣本中的 NDV 抗原。

3. 基礎(chǔ)研究：

   • 解析 HN 蛋白與 F 蛋白的相互作用機(jī)制（如結(jié)合位點(diǎn)、構(gòu)象變化傳遞），闡明病毒膜融合的分子機(jī)制，為設(shè)計(jì)阻斷劑（如靶向 HN-F 相互作用的肽類藥物）提供依據(jù)。
   • 研究不同毒株 HN 蛋白的變異（如受體結(jié)合位點(diǎn)突變）與宿主適應(yīng)性、致病性的關(guān)系，為 NDV 進(jìn)化分析和防控策略制定提供參考。

HN 蛋白是 NDV 感染和免疫的 “多功能蛋白”，其真核表達(dá)產(chǎn)物因保留天然結(jié)構(gòu)和活性，在新城疫的疫苗研發(fā)、診斷及機(jī)制研究中具有不可替代的價(jià)值。昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)憑借高效表達(dá)和低成本優(yōu)勢(shì)，成為 HN 真核蛋白規(guī)模化生產(chǎn)的主流選擇，為禽類傳染病的精準(zhǔn)防控提供了關(guān)鍵材料。