在抗體偶聯(lián)藥物（Antibody - drug conjugates，ADC）的復(fù)雜體系中，抗體內(nèi)化是 ADC 藥物發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？贵w作為 ADC 藥物的重要組成部分，其內(nèi)化能力直接影響藥物療效與安全性。

一、抗體內(nèi)化的分子機制與途徑探索

1.抗體內(nèi)化的本質(zhì)與細胞旅程
抗體內(nèi)化，即抗體內(nèi)吞，指細胞表面抗體與對應(yīng)抗原結(jié)合后，借助細胞自身運輸體系，將抗體 - 抗原復(fù)合物轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)部并發(fā)揮特定生物學功能的過程。大多數(shù) ADC 藥物分子以此方式進入細胞發(fā)揮對腫瘤細胞的毒性效應(yīng)。常規(guī)內(nèi)吞作用一般分為芽形成、膜彎曲與囊泡成熟、膜分裂并釋放至細胞質(zhì)三個階段，為抗體內(nèi)化提供了基本細胞生理基礎(chǔ)。

2.ADC 藥物內(nèi)化途徑的精細分類
對已上市 ADC 藥物內(nèi)化方式的研究表明，其內(nèi)化途徑依據(jù)是否依賴網(wǎng)格蛋白，可分為網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用（CME）與網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用兩類。其中，網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用又進一步細分為小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白 / GPI 錨定蛋白富集的早期內(nèi)體區(qū)室（CLIC/GEEC）和巨胞飲作用。

網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用是 ADC 藥物內(nèi)吞的重要途徑，其過程包含一系列緊密相連且部分重疊的步驟。不同受體觸發(fā) CME 的機制存在差異，既可以由質(zhì)膜上某些受體組成型啟動，也能通過受體與配體和 / 或抗體結(jié)合來開啟。當細胞質(zhì)中的內(nèi)吞衣殼蛋白開始在質(zhì)膜內(nèi)小葉聚集時，CME 起始。衣殼蛋白通過募集細胞質(zhì)中的額外接頭蛋白并與之相互作用，持續(xù)組裝與生長。關(guān)鍵銜接蛋白促使膜彎曲，將內(nèi)化受體 / 配體聚集到 “網(wǎng)格蛋白包被坑”（CCP）中。隨著 CCP 內(nèi)陷加深，其頸部收縮，通過斷裂過程與質(zhì)膜分離。肌動蛋白聚合助力 CCP “向內(nèi)” 進入細胞質(zhì)，直至分裂完成，CCP 轉(zhuǎn)變?yōu)榫W(wǎng)格蛋白包被的囊泡（CCV）。最終，CCV 外殼解體，CCV 與內(nèi)體融合并分選至特定亞細胞位置，或者循環(huán)回到細胞表面。這一過程的各步驟精確有序，確保了抗體內(nèi)化的高效進行。

二、影響抗體內(nèi)化的多元因素剖析

1.靶點
抗體能否被內(nèi)化，靶點起決定性作用。不同靶點具有特定結(jié)構(gòu)，只有與之匹配的抗體才能啟動內(nèi)化進程。而抗體內(nèi)化效率受多方面因素綜合影響。

2.抗體自身特性的影響
抗體的親和力與特異性對其內(nèi)化有重要影響。親和力高的抗體與抗原結(jié)合能力強，為內(nèi)化提供動力；特異性高的抗體能精準識別抗原，避免非特異性結(jié)合，確保內(nèi)化的準確性與高效性。

不同類型和亞型的抗體，通過不同的受體和信號通路影響內(nèi)化速度與效率。例如，IgG 和 IgA 內(nèi)化速度相對較快，而 IgM 和 IgE 內(nèi)化速度較慢，這反映了不同抗體在細胞內(nèi)運輸機制上的差異。

抗體的劑量和濃度對其內(nèi)化呈 “雙刃劍” 效應(yīng)。劑量和濃度增加，抗體與抗原結(jié)合機會增多，內(nèi)化可能性增大；但過高劑量和濃度可能導致受體飽和或下調(diào)，降低內(nèi)化效果。

3.細胞因素的影響
不同類型細胞的受體表達和內(nèi)化能力不同。B 細胞和巨噬細胞內(nèi)化能力較強，T 細胞和紅細胞內(nèi)化能力較弱，這種天然差異顯著影響抗體內(nèi)化效果。

細胞狀態(tài)是影響內(nèi)化動力學的重要因素?；罨毎麅?nèi)化速度較快，凋亡細胞內(nèi)化速度顯著減慢。此外，分子量較大的抗原通常更難被細胞內(nèi)化；針對同一靶點的不同抗體，因結(jié)構(gòu)等因素也會展現(xiàn)出不同的內(nèi)化效率。因此，在 ADC 藥物研發(fā)中，篩選高內(nèi)化效率的抗體對確保藥物安全性與有效性至關(guān)重要。

三、抗體內(nèi)化檢測技術(shù)的全景透視

1.基于活細胞成像的內(nèi)化檢測
基于活細胞成像的內(nèi)化檢測（Incucyte），通過實時活細胞成像儀對裸抗進行藥效動力學實時監(jiān)測。與傳統(tǒng)終點檢測不同，它采用多濃度點、多時間點檢測模式，可對活細胞進行長達 72 小時的連續(xù)觀察。這種動態(tài)監(jiān)測方式為深入了解抗體內(nèi)化過程提供了豐富時間序列數(shù)據(jù)，是研究抗體內(nèi)化的有力工具。

2.基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測
基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測主要包括 DT3C 法與 Mab - ZAP 方法。這兩種方法均利用抗體 - 毒素復(fù)合物在細胞內(nèi)釋放毒素引發(fā)細胞毒性的原理，通過檢測細胞殺傷情況評估抗體的內(nèi)化效果。DT3C 是 2014 年 MikiYamaguchi 等人利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白，由無受體結(jié)合域的白喉毒素（DT）和鏈球菌蛋白 G 的 C1、C2、C3（3C）結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；Mab - ZAP 由小鼠抗體和核糖體失活蛋白皂草素組成。相較于傳統(tǒng)的 Mab - ZAP 方法，DT3C 法中的 mAb - DT3C 偶聯(lián)物具有分子量更穩(wěn)定、內(nèi)化效率更高、適用性更廣、成本更低等優(yōu)勢，為抗體內(nèi)化檢測提供了更優(yōu)化選擇。

3.基于 pH 探針與溫度轉(zhuǎn)變的內(nèi)化檢測
基于 pH 探針的內(nèi)化檢測與基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測是細胞內(nèi)化過程檢測的常用方法。基于 pH 探針的內(nèi)化檢測利用熒光探針對 pH 值的敏感性，通過反映細胞內(nèi)囊泡的酸化程度判斷內(nèi)化進程與位置；基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測利用熒光二抗在不同溫度下熒光強度的變化，區(qū)分細胞內(nèi)外的熒光信號，進而判斷內(nèi)化效率與程度。

不過，這兩種方法各有優(yōu)缺點。基于 pH 探針的內(nèi)化檢測操作簡便，熒光信號清晰且可定量分析，適用于高通量篩選，但需精準選擇合適的 pH 敏感探針，并應(yīng)對其可能受到的多種干擾因素；基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測則需精確控制溫度變化，同時要考慮不同熒光二抗的溫度敏感性差異以及溫度轉(zhuǎn)變對細胞生理狀態(tài)和內(nèi)化動力學的潛在影響。

產(chǎn)品信息