文章標(biāo)題：Endoplasmic reticulum stress regulates swAInsonine-induced the autophagy in renal tubular ePIthelial cells through UPR signaling pathway
發(fā)表期刊：Science of the Total Environment，IF 8.0
合作客戶：西北農(nóng)林科技大學(xué)路浩團(tuán)隊(duì)
維真助力：自噬雙標(biāo)腺病毒
感染細(xì)胞：原代大鼠腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）
病毒產(chǎn)品：Ad-mcherry-GFP-LC3
MOI：30
感染時(shí)間：4h Ad-mcherry-GFP-LC3檢測(cè)RTECs自噬通量熒光圖 研究背景
瘋草（Locoweed）是一種有毒植物，苦馬豆素（SW）是瘋草的主要毒性成分，可誘導(dǎo)放牧牲畜產(chǎn)生毒性反應(yīng)。苦馬豆素誘導(dǎo)的毒性癥狀包括頭部震顫、共濟(jì)失調(diào)和肢體癱瘓，毒性機(jī)制仍有待研究。未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）通過(guò)減少蛋白質(zhì)合成和促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解，在緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）中起著關(guān)鍵作用。ERS與UPR和自噬激活密切相關(guān)，然而，UPR信號(hào)通路在SW誘導(dǎo)的ERS和自噬中的作用尚不清楚。 研究結(jié)果
1、SW誘導(dǎo)RTECs的ERS和UPR
作者研究發(fā)現(xiàn)SW誘導(dǎo)小鼠腎臟中的ERS、UPR和自噬，并可能通過(guò)觸發(fā)ERS、UPR和自噬共同導(dǎo)致腎臟損傷。進(jìn)一步分離大鼠原代RTECs，并用遞增濃度的SW處理12h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)空泡形成呈劑量依賴性增加，并且空泡數(shù)量呈時(shí)間依賴式增加。為了研究SW對(duì)ERS和UPR的影響，RTECs用SW處理12小時(shí)。WB分析顯示，與對(duì)照組相比，XBP1s、CHOP、GRP78、ATF6、p-IRE1α/IRE1α、p-eIF2α/eIF2α和p-PERK/PERK的蛋白表達(dá)水平以劑量依賴的方式顯著增加。同樣，Xbp1s、Chop、Ggp78、Atf6、Ire1α、Eif2α和Perk的mRNA水平也顯示出顯著的劑量依賴性增加。免疫熒光分析表明，綠色熒光強(qiáng)度隨著SW濃度的升高而逐漸增加，表明GRP78、XBP1s和ATF4蛋白的表達(dá)上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，SW誘導(dǎo)RTEC中ERS和UPR的激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SW以時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)ERS并激活UPR。
圖1. SW誘導(dǎo)大鼠原代RTECs的ERS和UPR 2、SW在原代大鼠RTECs中誘導(dǎo)自噬同時(shí)損害其進(jìn)展
由于細(xì)胞空泡化與自噬有關(guān)，作者研究了SW對(duì)自噬的影響。結(jié)果表明，自噬相關(guān)蛋白LC3-II、p62和ATG5的相對(duì)表達(dá)水平以SW劑量依賴和時(shí)間依賴的方式增加。Ad-GFP-mCherry-LC3自噬雙熒光標(biāo)記顯示，綠色和紅色熒光的強(qiáng)度隨著SW劑量的增加和持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。此外，黃色熒光（表示融合熒光）的強(qiáng)度也隨著劑量和時(shí)間的增加而增加，表明SW會(huì)損害自噬通量，表明SW在RTEC中誘導(dǎo)自噬，同時(shí)阻斷自噬通量。作者進(jìn)一步研究PERK、IRE1α和ATF6 三種UPR信號(hào)通路對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)：PERK通路通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)和增強(qiáng)自噬降解來(lái)調(diào)節(jié)SW誘導(dǎo)的自噬；IRE1α通路可能通過(guò)JNK和XBP1信號(hào)通路調(diào)節(jié)SW誘導(dǎo)的自噬；ATF6可能通過(guò)直接調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)SW誘導(dǎo)的自噬。 圖2. SW誘導(dǎo)原代大鼠RTEC的自噬 小結(jié)
本研究首次闡明了SW在RTECs中誘導(dǎo)的ERS激活UPR，并且闡明了ERS介導(dǎo)的UPR通路調(diào)節(jié)SW誘導(dǎo)的自噬的分子機(jī)制。在RTECs細(xì)胞培養(yǎng)模型中，PERK和ATF6主要通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)自噬；同時(shí)IRE1α可能通過(guò)兩種不同的機(jī)制調(diào)節(jié)自噬：通過(guò)IRE1α-XBP1通路調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，以及通過(guò)IRE1β-JNK信號(hào)通路直接調(diào)節(jié)自噬過(guò)程。本研究結(jié)果不僅加深了對(duì)SW毒理學(xué)機(jī)制的理解，也為預(yù)防和控制瘋草中毒提供了理論依據(jù)。