人基因組DNA甲基化長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序檢測(cè)方法比較_abio生物試劑品牌網(wǎng)
長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序最常用方法主要包括Oxford Nanopore Technologies（ONT）的納米孔測(cè)序和PacBio的單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測(cè)序。近日，冰島deCODE Genetics公司/雷克雅未克大學(xué)Brynja D. Sigurpalsdottir等人系統(tǒng)比較了長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)（ONT和SMRT測(cè)序）在檢測(cè)人基因組DNA甲基化（特別是CpG甲基化）方面的性能。研究共使用7,179個(gè)ONT測(cè)序樣本、132個(gè)精準(zhǔn)甲基化測(cè)序（oxBS）樣本和50個(gè)SMRT測(cè)序樣本，詳細(xì)評(píng)估不同測(cè)序技術(shù)和分析工具在檢測(cè)CpG甲基化（5-mCpG）時(shí)的準(zhǔn)確性、一致性及局限性。研究還引入了質(zhì)量過(guò)濾器以提高甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性，并強(qiáng)調(diào)了最新一代ONT R10.4芯片技術(shù)在甲基化檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)。相關(guān)研究成果以《A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes》為題發(fā)表于《Genome Biology》期刊。
標(biāo)題：A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes（人基因組DNA甲基化長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序檢測(cè)方法比較）
發(fā)表時(shí)間：2024-03-11
發(fā)表期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術(shù)平臺(tái)：ONT、oxBS、SMRT
DOI：10.1186/s13059-024-03207-9
本研究揭示了7,179個(gè)納米孔測(cè)序的DNA樣本中檢測(cè)到的CpG甲基化具有高度準(zhǔn)確性和一致性，與相同血液樣本中分離出來(lái)的132個(gè)精準(zhǔn)甲基化測(cè)序（oxBS）樣本的檢測(cè)結(jié)果相匹配。研究引入靶向CpG位點(diǎn)的質(zhì)量過(guò)濾器(過(guò)濾約30%的CpG)以進(jìn)一步提高納米孔測(cè)序CpG甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性。研究評(píng)估了在不同基因組特征和CpG甲基化率下，每個(gè)位點(diǎn)的CpG甲基化檢測(cè)性能，并展示了最新的ONT R10.4芯片和堿基識(shí)別算法優(yōu)化ONT納米孔測(cè)序中的甲基化檢測(cè)的具體過(guò)程。此外，研究還納入了50個(gè)SMRT測(cè)序樣本基因組的甲基化檢測(cè)結(jié)果和oxBS測(cè)序的結(jié)果，與ONT測(cè)序進(jìn)行橫向比較研究闡明了每種測(cè)序方法的優(yōu)勢(shì)和局限性，并為使用長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序進(jìn)行基因組規(guī)模的堿基修飾檢測(cè)工具的標(biāo)準(zhǔn)化和評(píng)估提出了建議。
研究方法
ONT測(cè)序：使用PromethION R9.4和R10.4芯片，通過(guò)檢測(cè)DNA分子通過(guò)納米孔時(shí)的電流變化來(lái)識(shí)別甲基化修飾。
SMRT測(cè)序：通過(guò)檢測(cè)DNA合成過(guò)程中堿基摻入的動(dòng)力學(xué)變化來(lái)識(shí)別甲基化修飾。
oxBS測(cè)序：通過(guò)化學(xué)氧化和亞硫酸鹽處理精準(zhǔn)區(qū)分5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）。
數(shù)據(jù)分析工具：
結(jié)果圖形
（1）ONT納米孔測(cè)序檢測(cè)CpG甲基化
研究首先利用promethION平臺(tái)對(duì)7,179名個(gè)體全血樣本進(jìn)行Nanopore測(cè)序，平均測(cè)序度為20.6×（中位數(shù)為19.5×，范圍從10×到108×）。同一樣本還被用于研究CpG甲基化、基因表達(dá)和序列變異之間的相關(guān)性。研究通過(guò)Nanopolish工具進(jìn)行CpG甲基化檢測(cè)，該工具將相距10bp以?xún)?nèi)的CpG位點(diǎn)歸為一個(gè)單元，稱(chēng)為CpG單元。Nanopolish以參考基因組比對(duì)的reads為input和每個(gè)read數(shù)據(jù)參考基因組的鏈信息，為每個(gè)CpG單元判斷其對(duì)數(shù)似然比（LLR）。LLR為二進(jìn)制值，表示測(cè)序CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)。當(dāng)LLR未達(dá)到預(yù)測(cè)CpG單元為甲基化或未甲基化標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將CpG單元分類(lèi)為“不可靠”。本研究分析范圍為隊(duì)列中Nanopolish檢測(cè)到的22,178,458個(gè)常染色體CpG單元，共27,651,488個(gè)CpG位點(diǎn)。
（2）ONT測(cè)序和oxBS的CpG甲基化檢測(cè)比較
研究對(duì)132個(gè)個(gè)體的DNA樣本進(jìn)行Nanopore測(cè)序和oxBS測(cè)序比較分析以評(píng)估Nanopore測(cè)序在CpG甲基化檢測(cè)中的準(zhǔn)確性。樣本平均測(cè)序深度為25×，每個(gè)CpG單元在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中分別計(jì)算了所有個(gè)體的平均5-mCpG率，并通過(guò)皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）來(lái)評(píng)估Nanopolish工具性能。結(jié)果顯示，兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的APC非常高（r=0.9594），表明Nanopore測(cè)序的甲基化檢測(cè)結(jié)果與oxBS測(cè)序結(jié)果高度一致。
圖1：ONT測(cè)序和oxBS在同一DNA樣本中5-甲基胞嘧啶（5-mCpG）率的一致性表現(xiàn)。
A. 132個(gè)DNA樣本中ONT（紅色）和oxBS（綠色）的5-mCpG率整體檢測(cè)值。
B-C. ONT測(cè)序中每個(gè)CpG位點(diǎn)的5-mCpG率的皮爾遜相關(guān)系數(shù)r（B）和平均絕對(duì)差異（MAD）（C）。
D. ONT測(cè)序樣本中用于分析特定CpG位點(diǎn)的5-mCpG率的序列數(shù)量（X軸），影響與oxBS高深度檢測(cè)5-mCpG率的一致性（皮爾遜相關(guān)系數(shù)r，Y軸）。
E. ONT測(cè)序（Y軸）和oxBS（X軸，分組）中的CpG率。平均值紅色（ONT）和綠色（oxBS）。
F. 樣本間比較通過(guò)ONT測(cè)序正確分類(lèi)的CpG位點(diǎn)數(shù)量（Y軸，單位=/M CpGs，藍(lán)色）。錯(cuò)誤分類(lèi)的CpG位點(diǎn)根據(jù)5-mCpG率的MAD著色（顏色圖例）。D/E/F中的oxBS位點(diǎn)測(cè)序深度>25×。
（3）測(cè)序深度影響ONT測(cè)序數(shù)據(jù)中CpG甲基化檢測(cè)的一致性
研究進(jìn)一步探討了測(cè)序深度對(duì)Nanopore測(cè)序CpG甲基化檢測(cè)一致性的影響。結(jié)果顯示，測(cè)序深度越高，CpG甲基化檢測(cè)一致性越好。當(dāng)測(cè)序深度在12×或更高時(shí)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)顯著提高，而20×或更高的測(cè)序深度時(shí)，檢測(cè)結(jié)果一致性進(jìn)一步提高。當(dāng)測(cè)序深度低于10×?xí)r，甲基化檢測(cè)準(zhǔn)確性會(huì)顯著下降。這一結(jié)果表明，較高的測(cè)序深度能夠顯著提高CpG甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性和一致性。為了獲得高準(zhǔn)確性的CpG甲基化檢測(cè)結(jié)果，建議每個(gè)樣本的測(cè)序深度至少為12×，20×或更高則更為理想。
（4）ONT測(cè)序數(shù)據(jù)在未甲基化和高甲基化CpG單元中的一致性更高
研究發(fā)現(xiàn)，ONT測(cè)序在未甲基化和高甲基化CpG單元的檢測(cè)上表現(xiàn)更為一致。研究將CpG位點(diǎn)分為未甲基化（0–0.15）、低甲基化（0.15–0.5）、中等甲基化（0.5–0.85）和高甲基化（0.85–1）四個(gè)類(lèi)別，通過(guò)比較ONT測(cè)序和oxBS的結(jié)果顯示，Nanopore測(cè)序在未甲基化和高甲基化CpG單元上的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性最高，分別為86%和77%。這表明Nanopore測(cè)序在極端甲基化狀態(tài)下檢測(cè)更為可靠，而在低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的檢測(cè)準(zhǔn)確性相對(duì)較低，分別為52%和56%。這一結(jié)果為研究者在選擇測(cè)序技術(shù)和分析工具時(shí)提供重要的參考依據(jù)。
（5）Nanopolish甲基化檢測(cè)質(zhì)量受CpG單元序列背景影響
研究發(fā)現(xiàn)，Nanopolish甲基化檢測(cè)質(zhì)量受CpG單元序列背景的影響。為了分析這種影響，研究者將CpG單元分為序列變異周?chē)?bp以?xún)?nèi)）、“暗區(qū)”（即難以可靠比對(duì)的區(qū)域）、具有異常測(cè)序深度（高于平均深度1.5倍或低于平均深度0.5倍）以及存在鏈偏倚（大于0.2）的4個(gè)CpG單元。分析結(jié)果表明，序列變異周?chē)鶦pG位點(diǎn)（5bp以?xún)?nèi)）的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較低，其APC為0.9219，而其他CpG位點(diǎn)的APC為0.9656。此外，“暗區(qū)”CpG位點(diǎn)APC也較低，為0.698。這些結(jié)果表明，序列背景對(duì)Nanopore測(cè)序的甲基化檢測(cè)準(zhǔn)確性有顯著影響。因此，在進(jìn)行CpG甲基化檢測(cè)時(shí)，需要特別關(guān)注這些區(qū)域的質(zhì)控，以提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
圖2：根據(jù)DNA序列屬性評(píng)估5-mCpG率檢測(cè)質(zhì)量。
A. 比較位于特定序列屬性?xún)?nèi)部（灰色）和外部（粉色）的CpG位點(diǎn)的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）。
B. 每個(gè)屬性?xún)?nèi)部的CpG單元（紅色）和位點(diǎn)（綠色）數(shù)量。
C. 單個(gè)CpG單元（單例）和多CpG位點(diǎn)單元（非單例）中高質(zhì)量（深藍(lán)色）與非高質(zhì)量（淺藍(lán)色）CpG單元的比例。
D. 不同甲基化狀態(tài)類(lèi)別中高質(zhì)量和非高質(zhì)量CpG單元比例。
（6）與oxBS數(shù)據(jù)的對(duì)比分析中，Guppy在CpG位點(diǎn)甲基化檢測(cè)上表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish
研究比較了Guppy和Nanopolish在CpG位點(diǎn)的甲基化檢測(cè)。分析結(jié)果表明Guppy在與oxBS測(cè)序結(jié)果的對(duì)比分析中表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish。具體而言，Guppy與oxBS測(cè)序結(jié)果的APC為0.97256，高于Nanopolish的0.9594。且Guppy平均鏈偏倚更低，表明其甲基化檢測(cè)準(zhǔn)確性更高。通過(guò)應(yīng)用與Nanopolish相同的質(zhì)量過(guò)濾器，Guppy能夠鑒定出更多的高質(zhì)量CpG位點(diǎn)（hq-CpGs），其APC為0.98691。這一結(jié)果表明，Guppy在CpG甲基化檢測(cè)上具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性，特別是在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點(diǎn)時(shí)表現(xiàn)更為出色。
（7）最新的Nanopore R10.4芯片技術(shù)在甲基化檢測(cè)上實(shí)現(xiàn)了更高準(zhǔn)確性和改進(jìn)的檢測(cè)結(jié)果
研究人員對(duì)ONT的最新R10.4芯片在CpG甲基化檢測(cè)方面的表現(xiàn)進(jìn)行了評(píng)估，并與早期的R9.4芯片進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，R10.4芯片在多個(gè)方面表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)，特別是在提高甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性和減少鏈偏倚方面。
（8）ONT測(cè)序與SMRT測(cè)序的CpG甲基化檢測(cè)比較
研究以50個(gè)oxBS樣本作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)50個(gè)SMRT測(cè)序樣本、50個(gè)ONT測(cè)序樣本（分別使用R9.4和R10.4芯片）的CpG甲基化檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。研究對(duì)所有樣本的平均5-mCpG率進(jìn)行分析，并比較所有五種方法（SMRT、R9.4-Guppy、R10.4-Guppy、R9.4-Nanopolish和oxBS）之間的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）以及5-mCpG率與oxBS之間的平均絕對(duì)差異（MAD）（表1A）。
表1：不同測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化檢測(cè)中的一致性和準(zhǔn)確性比較
(A) APC比較結(jié)果展示在主對(duì)角線以下，MMAD比較結(jié)果展示在主對(duì)角線以上。
(B) 基于所有CpG、序列變異周?chē)鶦pG或暗區(qū)CpG位點(diǎn)的APC比較分析。
結(jié)果顯示，Guppy R10.4和Guppy R9.4在與oxBS數(shù)據(jù)的比較中表現(xiàn)最佳，其平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）最高，分別為0.97845和0.97256。表明Guppy在甲基化檢測(cè)上的準(zhǔn)確性最高，能夠最接近oxBS測(cè)序的參考標(biāo)準(zhǔn)。研究還分析了不同測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。所有測(cè)序技術(shù)均能準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)oxBS測(cè)序觀察到的CpG甲基化率的雙峰分布，Guppy R10.4的分布與oxBS測(cè)序結(jié)果最為接近，表明其在極端甲基化狀態(tài)下的檢測(cè)更為準(zhǔn)確。
此外，CpG周?chē)男蛄凶儺悤?huì)在oxBS中引入比對(duì)偏倚，導(dǎo)致甲基化檢測(cè)不準(zhǔn)確和APC降低（表1B）。因此對(duì)于Guppy和PacBio而言，序列變異周?chē)鶦pG位點(diǎn)的重要性較低。所有長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)都使用特定序列背景和與參考基因組的比較來(lái)檢測(cè)CpG甲基化狀態(tài)，因此可以過(guò)濾那些序列變異周?chē)腃pG位點(diǎn)。
（9）5-mCpG率的分布
研究分析了不同測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。結(jié)果顯示，所有測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化率的分布上表現(xiàn)出預(yù)期的雙峰分布，但在完全甲基化和完全未甲基化狀態(tài)下的分布略有差異。Guppy R10.4測(cè)序結(jié)果與oxBS測(cè)序結(jié)果最為接近，而SMRT測(cè)序和Guppy R9.4測(cè)序結(jié)果則在極端甲基化狀態(tài)下表現(xiàn)出一定的偏倚。這一結(jié)果表明，不同測(cè)序技術(shù)在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點(diǎn)時(shí)可能存在差異，研究者在選擇測(cè)序技術(shù)時(shí)需要考慮這些因素。
圖3：不同方法檢測(cè)CpG甲基化的比較。
A. 在oxBS、Guppy R9.4和R10.4中，CpG甲基化率（0-1）在個(gè)體中平均后呈現(xiàn)出oxBS數(shù)據(jù)中預(yù)期的雙峰分布。
B. 在oxBS、PacBio和Nanopore中，CpG甲基化率（0-1）在個(gè)體中平均后呈現(xiàn)出oxBS數(shù)據(jù)中預(yù)期的雙峰分布。
C. 全血中表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的CpG甲基化率在50bp范圍內(nèi)平均值。
D. 每種方法檢測(cè)到的CpG位點(diǎn)數(shù)量。Nanopolish統(tǒng)計(jì)每個(gè)CpG單元的所有CpG位點(diǎn)。
（10）功能區(qū)域的5-mCpG分布
為了研究生物學(xué)背景對(duì)甲基化檢測(cè)準(zhǔn)確性的作用，研究人員分析了全血中表達(dá)基因的TSS處50bp以?xún)?nèi)的平均5-mCpG率。所有甲基化檢測(cè)方法都高度匹配oxBS測(cè)序樣本中的甲基化模式，表明在TSS區(qū)域內(nèi)甲基化缺失（圖3C）。其中PacBio和Guppy R9.4在TSS處顯示出更高的CpG甲基化率，而在TSS之外則顯示出低甲基化率，這與這兩種方法的甲基化分布輕微偏移一致（圖3A、B）。而Guppy R10.4測(cè)序結(jié)果更接近于oxBS中的TSS甲基化水平（圖3C）。表明其在功能區(qū)域的甲基化檢測(cè)上具有高準(zhǔn)確性。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Guppy R10.4測(cè)序技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用潛力，特別是在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞分化機(jī)制研究中。
（11）長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序比oxBS測(cè)序檢測(cè)到更多的CpG位點(diǎn)數(shù)量
研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)CpG位點(diǎn)數(shù)量上優(yōu)于oxBS測(cè)序。Nanopore測(cè)序和SMRT測(cè)序平均每個(gè)樣本檢測(cè)到約27M CpG位點(diǎn)（Guppy R9.4=27,467,383個(gè)CpG位點(diǎn)，Guppy R10.4=27369144個(gè)CpG位點(diǎn)，PacBio=26,739,539個(gè)CpG位點(diǎn)，Nanopolish=26,487,587個(gè)CpG位點(diǎn)，分布在22,058,476個(gè)CpG單元中），而oxBS測(cè)序僅檢測(cè)到約26M CpG位點(diǎn)（圖3D）。這一結(jié)果表明，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化檢測(cè)上具有更高的分辨率和更全面的覆蓋范圍，能夠?yàn)檠芯空咛峁└S富的表觀遺傳學(xué)信息。這一優(yōu)勢(shì)在研究復(fù)雜基因組區(qū)域和稀有甲基化中尤為顯著。
討論和啟示
本研究通過(guò)大規(guī)模樣本分析，揭示了長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)和局限性。研究揭示了測(cè)序深度、鏈偏倚、序列背景等因素對(duì)甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性有顯著影響。同時(shí)，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)CpG甲基化方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，尤其是在無(wú)需化學(xué)處理DNA的情況下直接檢測(cè)甲基化修飾的能力。最新的R10.4芯片技術(shù)，通過(guò)降低鏈偏倚和提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，進(jìn)一步提升了ONT測(cè)序在甲基化檢測(cè)中的性能。未來(lái)的研究可以利用這些技術(shù)優(yōu)勢(shì)，深入探索基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化以及疾病發(fā)生機(jī)制等領(lǐng)域的表觀遺傳學(xué)變化。
參考文獻(xiàn)：
Sigurpalsdottir, B.D., Stefansson, O.A., Holley, G. et al. A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes. Genome Biol 25, 69 (2024). Doi：10.1186/s13059-024-03207-9
標(biāo)題：A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes（人基因組DNA甲基化長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序檢測(cè)方法比較）
發(fā)表時(shí)間：2024-03-11
發(fā)表期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術(shù)平臺(tái)：ONT、oxBS、SMRT
DOI：10.1186/s13059-024-03207-9
本研究揭示了7,179個(gè)納米孔測(cè)序的DNA樣本中檢測(cè)到的CpG甲基化具有高度準(zhǔn)確性和一致性，與相同血液樣本中分離出來(lái)的132個(gè)精準(zhǔn)甲基化測(cè)序（oxBS）樣本的檢測(cè)結(jié)果相匹配。研究引入靶向CpG位點(diǎn)的質(zhì)量過(guò)濾器(過(guò)濾約30%的CpG)以進(jìn)一步提高納米孔測(cè)序CpG甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性。研究評(píng)估了在不同基因組特征和CpG甲基化率下，每個(gè)位點(diǎn)的CpG甲基化檢測(cè)性能，并展示了最新的ONT R10.4芯片和堿基識(shí)別算法優(yōu)化ONT納米孔測(cè)序中的甲基化檢測(cè)的具體過(guò)程。此外，研究還納入了50個(gè)SMRT測(cè)序樣本基因組的甲基化檢測(cè)結(jié)果和oxBS測(cè)序的結(jié)果，與ONT測(cè)序進(jìn)行橫向比較研究闡明了每種測(cè)序方法的優(yōu)勢(shì)和局限性，并為使用長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序進(jìn)行基因組規(guī)模的堿基修飾檢測(cè)工具的標(biāo)準(zhǔn)化和評(píng)估提出了建議。
研究方法
ONT測(cè)序：使用PromethION R9.4和R10.4芯片，通過(guò)檢測(cè)DNA分子通過(guò)納米孔時(shí)的電流變化來(lái)識(shí)別甲基化修飾。
SMRT測(cè)序：通過(guò)檢測(cè)DNA合成過(guò)程中堿基摻入的動(dòng)力學(xué)變化來(lái)識(shí)別甲基化修飾。
oxBS測(cè)序：通過(guò)化學(xué)氧化和亞硫酸鹽處理精準(zhǔn)區(qū)分5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）。
數(shù)據(jù)分析工具：
- Nanopolish：使用隱馬爾可夫模型（HMM）為每個(gè)CpG位點(diǎn)分配甲基化狀態(tài)。
- Guppy：基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）工具，可在堿基識(shí)別階段直接檢測(cè)CpG甲基化。
- Primrose：SMRT測(cè)序數(shù)據(jù)的甲基化檢測(cè)，通過(guò)結(jié)合鄰近CpG位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)信息來(lái)提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。
結(jié)果圖形
（1）ONT納米孔測(cè)序檢測(cè)CpG甲基化
研究首先利用promethION平臺(tái)對(duì)7,179名個(gè)體全血樣本進(jìn)行Nanopore測(cè)序，平均測(cè)序度為20.6×（中位數(shù)為19.5×，范圍從10×到108×）。同一樣本還被用于研究CpG甲基化、基因表達(dá)和序列變異之間的相關(guān)性。研究通過(guò)Nanopolish工具進(jìn)行CpG甲基化檢測(cè)，該工具將相距10bp以?xún)?nèi)的CpG位點(diǎn)歸為一個(gè)單元，稱(chēng)為CpG單元。Nanopolish以參考基因組比對(duì)的reads為input和每個(gè)read數(shù)據(jù)參考基因組的鏈信息，為每個(gè)CpG單元判斷其對(duì)數(shù)似然比（LLR）。LLR為二進(jìn)制值，表示測(cè)序CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)。當(dāng)LLR未達(dá)到預(yù)測(cè)CpG單元為甲基化或未甲基化標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將CpG單元分類(lèi)為“不可靠”。本研究分析范圍為隊(duì)列中Nanopolish檢測(cè)到的22,178,458個(gè)常染色體CpG單元，共27,651,488個(gè)CpG位點(diǎn)。
（2）ONT測(cè)序和oxBS的CpG甲基化檢測(cè)比較
研究對(duì)132個(gè)個(gè)體的DNA樣本進(jìn)行Nanopore測(cè)序和oxBS測(cè)序比較分析以評(píng)估Nanopore測(cè)序在CpG甲基化檢測(cè)中的準(zhǔn)確性。樣本平均測(cè)序深度為25×，每個(gè)CpG單元在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中分別計(jì)算了所有個(gè)體的平均5-mCpG率，并通過(guò)皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）來(lái)評(píng)估Nanopolish工具性能。結(jié)果顯示，兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的APC非常高（r=0.9594），表明Nanopore測(cè)序的甲基化檢測(cè)結(jié)果與oxBS測(cè)序結(jié)果高度一致。
圖1：ONT測(cè)序和oxBS在同一DNA樣本中5-甲基胞嘧啶（5-mCpG）率的一致性表現(xiàn)。
A. 132個(gè)DNA樣本中ONT（紅色）和oxBS（綠色）的5-mCpG率整體檢測(cè)值。
B-C. ONT測(cè)序中每個(gè)CpG位點(diǎn)的5-mCpG率的皮爾遜相關(guān)系數(shù)r（B）和平均絕對(duì)差異（MAD）（C）。
D. ONT測(cè)序樣本中用于分析特定CpG位點(diǎn)的5-mCpG率的序列數(shù)量（X軸），影響與oxBS高深度檢測(cè)5-mCpG率的一致性（皮爾遜相關(guān)系數(shù)r，Y軸）。
E. ONT測(cè)序（Y軸）和oxBS（X軸，分組）中的CpG率。平均值紅色（ONT）和綠色（oxBS）。
F. 樣本間比較通過(guò)ONT測(cè)序正確分類(lèi)的CpG位點(diǎn)數(shù)量（Y軸，單位=/M CpGs，藍(lán)色）。錯(cuò)誤分類(lèi)的CpG位點(diǎn)根據(jù)5-mCpG率的MAD著色（顏色圖例）。D/E/F中的oxBS位點(diǎn)測(cè)序深度>25×。
（3）測(cè)序深度影響ONT測(cè)序數(shù)據(jù)中CpG甲基化檢測(cè)的一致性
研究進(jìn)一步探討了測(cè)序深度對(duì)Nanopore測(cè)序CpG甲基化檢測(cè)一致性的影響。結(jié)果顯示，測(cè)序深度越高，CpG甲基化檢測(cè)一致性越好。當(dāng)測(cè)序深度在12×或更高時(shí)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)顯著提高，而20×或更高的測(cè)序深度時(shí)，檢測(cè)結(jié)果一致性進(jìn)一步提高。當(dāng)測(cè)序深度低于10×?xí)r，甲基化檢測(cè)準(zhǔn)確性會(huì)顯著下降。這一結(jié)果表明，較高的測(cè)序深度能夠顯著提高CpG甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性和一致性。為了獲得高準(zhǔn)確性的CpG甲基化檢測(cè)結(jié)果，建議每個(gè)樣本的測(cè)序深度至少為12×，20×或更高則更為理想。
（4）ONT測(cè)序數(shù)據(jù)在未甲基化和高甲基化CpG單元中的一致性更高
研究發(fā)現(xiàn)，ONT測(cè)序在未甲基化和高甲基化CpG單元的檢測(cè)上表現(xiàn)更為一致。研究將CpG位點(diǎn)分為未甲基化（0–0.15）、低甲基化（0.15–0.5）、中等甲基化（0.5–0.85）和高甲基化（0.85–1）四個(gè)類(lèi)別，通過(guò)比較ONT測(cè)序和oxBS的結(jié)果顯示，Nanopore測(cè)序在未甲基化和高甲基化CpG單元上的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性最高，分別為86%和77%。這表明Nanopore測(cè)序在極端甲基化狀態(tài)下檢測(cè)更為可靠，而在低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的檢測(cè)準(zhǔn)確性相對(duì)較低，分別為52%和56%。這一結(jié)果為研究者在選擇測(cè)序技術(shù)和分析工具時(shí)提供重要的參考依據(jù)。
（5）Nanopolish甲基化檢測(cè)質(zhì)量受CpG單元序列背景影響
研究發(fā)現(xiàn)，Nanopolish甲基化檢測(cè)質(zhì)量受CpG單元序列背景的影響。為了分析這種影響，研究者將CpG單元分為序列變異周?chē)?bp以?xún)?nèi)）、“暗區(qū)”（即難以可靠比對(duì)的區(qū)域）、具有異常測(cè)序深度（高于平均深度1.5倍或低于平均深度0.5倍）以及存在鏈偏倚（大于0.2）的4個(gè)CpG單元。分析結(jié)果表明，序列變異周?chē)鶦pG位點(diǎn)（5bp以?xún)?nèi)）的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較低，其APC為0.9219，而其他CpG位點(diǎn)的APC為0.9656。此外，“暗區(qū)”CpG位點(diǎn)APC也較低，為0.698。這些結(jié)果表明，序列背景對(duì)Nanopore測(cè)序的甲基化檢測(cè)準(zhǔn)確性有顯著影響。因此，在進(jìn)行CpG甲基化檢測(cè)時(shí)，需要特別關(guān)注這些區(qū)域的質(zhì)控，以提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
圖2：根據(jù)DNA序列屬性評(píng)估5-mCpG率檢測(cè)質(zhì)量。
A. 比較位于特定序列屬性?xún)?nèi)部（灰色）和外部（粉色）的CpG位點(diǎn)的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）。
B. 每個(gè)屬性?xún)?nèi)部的CpG單元（紅色）和位點(diǎn)（綠色）數(shù)量。
C. 單個(gè)CpG單元（單例）和多CpG位點(diǎn)單元（非單例）中高質(zhì)量（深藍(lán)色）與非高質(zhì)量（淺藍(lán)色）CpG單元的比例。
D. 不同甲基化狀態(tài)類(lèi)別中高質(zhì)量和非高質(zhì)量CpG單元比例。
（6）與oxBS數(shù)據(jù)的對(duì)比分析中，Guppy在CpG位點(diǎn)甲基化檢測(cè)上表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish
研究比較了Guppy和Nanopolish在CpG位點(diǎn)的甲基化檢測(cè)。分析結(jié)果表明Guppy在與oxBS測(cè)序結(jié)果的對(duì)比分析中表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish。具體而言，Guppy與oxBS測(cè)序結(jié)果的APC為0.97256，高于Nanopolish的0.9594。且Guppy平均鏈偏倚更低，表明其甲基化檢測(cè)準(zhǔn)確性更高。通過(guò)應(yīng)用與Nanopolish相同的質(zhì)量過(guò)濾器，Guppy能夠鑒定出更多的高質(zhì)量CpG位點(diǎn)（hq-CpGs），其APC為0.98691。這一結(jié)果表明，Guppy在CpG甲基化檢測(cè)上具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性，特別是在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點(diǎn)時(shí)表現(xiàn)更為出色。
（7）最新的Nanopore R10.4芯片技術(shù)在甲基化檢測(cè)上實(shí)現(xiàn)了更高準(zhǔn)確性和改進(jìn)的檢測(cè)結(jié)果
研究人員對(duì)ONT的最新R10.4芯片在CpG甲基化檢測(cè)方面的表現(xiàn)進(jìn)行了評(píng)估，并與早期的R9.4芯片進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，R10.4芯片在多個(gè)方面表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)，特別是在提高甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性和減少鏈偏倚方面。
- 更高的APC：在所有CpG位點(diǎn)中，R10.4芯片預(yù)測(cè)的5-mCpG率與oxBS數(shù)據(jù)的APC為0.97845，高于R9.4芯片的0.97256。表明R10.4芯片在甲基化檢測(cè)上的準(zhǔn)確性更高。
- 更低的MAD：Guppy R10.4在與oxBS的甲基化檢測(cè)比較中顯示出比Guppy R9.4更低的MAD，進(jìn)一步證明了其在甲基化檢測(cè)上的準(zhǔn)確性。
- 更低的鏈偏倚：R10.4芯片的平均鏈偏倚為0.047，顯著低于R9.4芯片的0.064。鏈偏倚是指正鏈和負(fù)鏈上預(yù)測(cè)的甲基化率差異，較低的鏈偏倚表明R10.4芯片在甲基化檢測(cè)上的可靠性更高。
- 更多的高質(zhì)量CpG位點(diǎn)：應(yīng)用相同的質(zhì)量過(guò)濾器，R10.4芯片能夠鑒定出更多的高質(zhì)量CpG位點(diǎn)（hq-CpGs），數(shù)量達(dá)到22893522個(gè)（82.8%），與R9.4芯片相比增加了2.3%。表明R10.4芯片在提高甲基化檢測(cè)位點(diǎn)覆蓋率方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。
- 高質(zhì)量CpG位點(diǎn)更高的APC：這些高質(zhì)量CpG位點(diǎn)的APC為0.99067，表明R10.4芯片在甲基化檢測(cè)上的準(zhǔn)確性非常高。
（8）ONT測(cè)序與SMRT測(cè)序的CpG甲基化檢測(cè)比較
研究以50個(gè)oxBS樣本作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)50個(gè)SMRT測(cè)序樣本、50個(gè)ONT測(cè)序樣本（分別使用R9.4和R10.4芯片）的CpG甲基化檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。研究對(duì)所有樣本的平均5-mCpG率進(jìn)行分析，并比較所有五種方法（SMRT、R9.4-Guppy、R10.4-Guppy、R9.4-Nanopolish和oxBS）之間的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）以及5-mCpG率與oxBS之間的平均絕對(duì)差異（MAD）（表1A）。
表1：不同測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化檢測(cè)中的一致性和準(zhǔn)確性比較
(A) APC比較結(jié)果展示在主對(duì)角線以下，MMAD比較結(jié)果展示在主對(duì)角線以上。
(B) 基于所有CpG、序列變異周?chē)鶦pG或暗區(qū)CpG位點(diǎn)的APC比較分析。
結(jié)果顯示，Guppy R10.4和Guppy R9.4在與oxBS數(shù)據(jù)的比較中表現(xiàn)最佳，其平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）最高，分別為0.97845和0.97256。表明Guppy在甲基化檢測(cè)上的準(zhǔn)確性最高，能夠最接近oxBS測(cè)序的參考標(biāo)準(zhǔn)。研究還分析了不同測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。所有測(cè)序技術(shù)均能準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)oxBS測(cè)序觀察到的CpG甲基化率的雙峰分布，Guppy R10.4的分布與oxBS測(cè)序結(jié)果最為接近，表明其在極端甲基化狀態(tài)下的檢測(cè)更為準(zhǔn)確。
此外，CpG周?chē)男蛄凶儺悤?huì)在oxBS中引入比對(duì)偏倚，導(dǎo)致甲基化檢測(cè)不準(zhǔn)確和APC降低（表1B）。因此對(duì)于Guppy和PacBio而言，序列變異周?chē)鶦pG位點(diǎn)的重要性較低。所有長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)都使用特定序列背景和與參考基因組的比較來(lái)檢測(cè)CpG甲基化狀態(tài)，因此可以過(guò)濾那些序列變異周?chē)腃pG位點(diǎn)。
（9）5-mCpG率的分布
研究分析了不同測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。結(jié)果顯示，所有測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化率的分布上表現(xiàn)出預(yù)期的雙峰分布，但在完全甲基化和完全未甲基化狀態(tài)下的分布略有差異。Guppy R10.4測(cè)序結(jié)果與oxBS測(cè)序結(jié)果最為接近，而SMRT測(cè)序和Guppy R9.4測(cè)序結(jié)果則在極端甲基化狀態(tài)下表現(xiàn)出一定的偏倚。這一結(jié)果表明，不同測(cè)序技術(shù)在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點(diǎn)時(shí)可能存在差異，研究者在選擇測(cè)序技術(shù)時(shí)需要考慮這些因素。
圖3：不同方法檢測(cè)CpG甲基化的比較。
A. 在oxBS、Guppy R9.4和R10.4中，CpG甲基化率（0-1）在個(gè)體中平均后呈現(xiàn)出oxBS數(shù)據(jù)中預(yù)期的雙峰分布。
B. 在oxBS、PacBio和Nanopore中，CpG甲基化率（0-1）在個(gè)體中平均后呈現(xiàn)出oxBS數(shù)據(jù)中預(yù)期的雙峰分布。
C. 全血中表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的CpG甲基化率在50bp范圍內(nèi)平均值。
D. 每種方法檢測(cè)到的CpG位點(diǎn)數(shù)量。Nanopolish統(tǒng)計(jì)每個(gè)CpG單元的所有CpG位點(diǎn)。
（10）功能區(qū)域的5-mCpG分布
為了研究生物學(xué)背景對(duì)甲基化檢測(cè)準(zhǔn)確性的作用，研究人員分析了全血中表達(dá)基因的TSS處50bp以?xún)?nèi)的平均5-mCpG率。所有甲基化檢測(cè)方法都高度匹配oxBS測(cè)序樣本中的甲基化模式，表明在TSS區(qū)域內(nèi)甲基化缺失（圖3C）。其中PacBio和Guppy R9.4在TSS處顯示出更高的CpG甲基化率，而在TSS之外則顯示出低甲基化率，這與這兩種方法的甲基化分布輕微偏移一致（圖3A、B）。而Guppy R10.4測(cè)序結(jié)果更接近于oxBS中的TSS甲基化水平（圖3C）。表明其在功能區(qū)域的甲基化檢測(cè)上具有高準(zhǔn)確性。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Guppy R10.4測(cè)序技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用潛力，特別是在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞分化機(jī)制研究中。
（11）長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序比oxBS測(cè)序檢測(cè)到更多的CpG位點(diǎn)數(shù)量
研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)CpG位點(diǎn)數(shù)量上優(yōu)于oxBS測(cè)序。Nanopore測(cè)序和SMRT測(cè)序平均每個(gè)樣本檢測(cè)到約27M CpG位點(diǎn)（Guppy R9.4=27,467,383個(gè)CpG位點(diǎn)，Guppy R10.4=27369144個(gè)CpG位點(diǎn)，PacBio=26,739,539個(gè)CpG位點(diǎn)，Nanopolish=26,487,587個(gè)CpG位點(diǎn)，分布在22,058,476個(gè)CpG單元中），而oxBS測(cè)序僅檢測(cè)到約26M CpG位點(diǎn)（圖3D）。這一結(jié)果表明，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化檢測(cè)上具有更高的分辨率和更全面的覆蓋范圍，能夠?yàn)檠芯空咛峁└S富的表觀遺傳學(xué)信息。這一優(yōu)勢(shì)在研究復(fù)雜基因組區(qū)域和稀有甲基化中尤為顯著。
討論和啟示
本研究通過(guò)大規(guī)模樣本分析，揭示了長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在CpG甲基化檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)和局限性。研究揭示了測(cè)序深度、鏈偏倚、序列背景等因素對(duì)甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性有顯著影響。同時(shí)，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)CpG甲基化方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，尤其是在無(wú)需化學(xué)處理DNA的情況下直接檢測(cè)甲基化修飾的能力。最新的R10.4芯片技術(shù)，通過(guò)降低鏈偏倚和提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，進(jìn)一步提升了ONT測(cè)序在甲基化檢測(cè)中的性能。未來(lái)的研究可以利用這些技術(shù)優(yōu)勢(shì)，深入探索基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化以及疾病發(fā)生機(jī)制等領(lǐng)域的表觀遺傳學(xué)變化。
參考文獻(xiàn)：
Sigurpalsdottir, B.D., Stefansson, O.A., Holley, G. et al. A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes. Genome Biol 25, 69 (2024). Doi：10.1186/s13059-024-03207-9
本站“ABIO生物試劑品牌網(wǎng)”圖片文字來(lái)自互聯(lián)網(wǎng)
如果有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系微信: nanhu9181 處理，感謝~
