肥胖會引發(fā)一系列的疾病，如糖尿病、心腦血管疾病、非酒精性脂肪肝甚至腫瘤等。棕色脂肪組織（Brown adipose tissue，BAT）作為一個產(chǎn)熱器官能將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮埽诰S持機(jī)體體溫和能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用，提高棕色脂肪的產(chǎn)熱能力對肥胖的治療具有非常重要的意義。棕色脂肪從胚胎期開始發(fā)育，但是關(guān)于棕色脂肪發(fā)育調(diào)控的研究并不清楚。本課題致力于找到調(diào)控棕色脂肪發(fā)育和功能的機(jī)制，為肥胖的治療提供可能的靶點(diǎn)。

2024年10月15日，廈門大學(xué)生科院在《Cell Death & Differentiation》（生物學(xué)1區(qū)Top， IF=13.7）發(fā)表題目為SOX4 facilitates brown fat development and mAIntenance through EBF2-mediated thermogenic gene program in mice的論文,初步闡明了SOX4對棕色脂肪發(fā)育的影響，揭示了SOX4通過EBF2調(diào)控棕色脂肪發(fā)育和功能的具體機(jī)制。廈門大學(xué)生科院和醫(yī)學(xué)院博士后王帥、何婷、博士羅芽是該文章的共同第一作者，李博安教授和郭慧玲副教授，廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院李衛(wèi)華教授以及廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院李奇淵教授為該文章的通訊作者[1]。
 

BAT作為一種產(chǎn)熱器官，能夠?qū)⒒瘜W(xué)能轉(zhuǎn)化為熱能，對維持機(jī)體的體溫和能量平衡起著關(guān)鍵作用。因此，增強(qiáng)棕色脂肪的產(chǎn)熱能力對治療肥胖具有重要意義。盡管棕色脂肪自胚胎階段就開始發(fā)育，但其發(fā)育調(diào)控的具體機(jī)制仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)在BAT前體細(xì)胞（Sox4-MKO）或棕色脂肪細(xì)胞（Sox4-BKO）中敲除SOX4會導(dǎo)致BAT白化，并在急性冷暴露下出現(xiàn)低溫癥。Sox4-MKO小鼠的產(chǎn)熱能力降低，使其對飲食誘導(dǎo)的肥胖更易感。相反，在BAT中過表達(dá)SOX4可以增強(qiáng)產(chǎn)熱能力，對抗飲食誘導(dǎo)的肥胖。從機(jī)制上講，SOX4激活EBF2的轉(zhuǎn)錄，而EBF2決定了褐色脂肪的命運(yùn)。此外，SOX4在S235位點(diǎn)的磷酸化通過PKA促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位進(jìn)一步促進(jìn)EBF2轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步地，SOX4與EBF2結(jié)合，激活調(diào)控產(chǎn)熱基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄程序。

研究材料：
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：Pref1-Sox4小鼠由賽業(yè)（Cyagen）公司構(gòu)建。小鼠在特定條件下被飼養(yǎng)在群體籠中：溫度保持在22–24 °C，相對濕度為50–60%，并設(shè)定12小時的明暗循環(huán)，光照從早上7:00開始。所有小鼠均為年齡匹配的雄性C57BL/6遺傳背景的小鼠。

在冷耐受測試（CTT）中，小鼠在測試前一周被單獨(dú)飼養(yǎng)在22 °C的籠子里。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，小鼠禁食4小時，飲水后轉(zhuǎn)移至4 °C的單獨(dú)籠中。在規(guī)定時間內(nèi)，使用直腸溫度計(jì)（NJKEWBIO, FT3400）測量直腸溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有小鼠被安樂死以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

體外實(shí)驗(yàn)：研究人員構(gòu)建了BAT SVF永生化的細(xì)胞系，利用慢病毒進(jìn)行敲低和過表達(dá)，在進(jìn)行體外分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

技術(shù)方法
通過RNA-seq，ChIP-qPCR, FAIRE assay，OCR、小鼠代謝籠，免疫共沉淀、QPCR、免疫熒光染色、染色質(zhì)免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)分析。

技術(shù)路線

研究結(jié)果
1 棕色脂肪的發(fā)育和功能維持需要SOX4的參與
為了探究SOX4的缺失對棕色脂肪的影響，研究人員分別取出生后一天（P1天）和成年后小鼠（8周齡）的棕色脂肪組織進(jìn)行H＆E染色分析。如圖1 A所示，P1天的Sox4-MKO小鼠棕色脂肪的白化程度高于其對照組，H＆E染色結(jié)果進(jìn)一步說明了Sox4-MKO小鼠棕色脂肪的脂滴相對于其對照組更大（圖1 B）。8周齡的Sox4-MKO小鼠棕色脂肪的白化程度依然高于其對照組，如圖1 C-D所示。由于棕色脂肪從胚胎期就開始發(fā)育，研究人員進(jìn)一步檢測了兩組小鼠在胚胎期第15.5天（E15.5天）棕色脂肪的形態(tài)，如圖1 E所示，Sox4-MKO小鼠的棕色脂肪明顯比其對照組小，UCP1的表達(dá)量也明顯低于對照組。以上結(jié)果表明棕色脂肪的發(fā)育需要SOX4的參與。
 

小鼠棕色脂肪的發(fā)育需要SOX4的參與

（A-B）出生后一天（雄鼠）的Sox4^f/f和Sox4-MKO小鼠背部棕色脂肪的解剖圖（A），（B）為兩組小鼠棕色脂肪的H＆E染色圖，標(biāo)尺為25 μm。（C-D）8周齡（雄鼠）的Sox4^f/f和Sox4-MKO小鼠背部棕色脂肪的解剖圖（C），（D）為兩組小鼠棕色脂肪的H＆E染色圖，標(biāo)尺為75 μm。（E）E15.5天（雄鼠）的Sox4^f/f和Sox4-MKO小鼠背部棕色脂肪橫切面的H＆E染色圖和UCP1免疫熒光染色圖，標(biāo)尺如圖所示。

為了進(jìn)一步探究SOX4是否能抑制棕色脂肪的白化，研究人員進(jìn)一步分析了在棕色脂肪祖細(xì)胞中過表達(dá)SOX4小鼠模型（Pref1-Sox4小鼠）的表型。首先研究人員先檢測了WT組小鼠和Pref1-Sox4組小鼠BAT SVF中SOX4的表達(dá)量，如圖2A所示，Pref1-Sox4組小鼠BAT SVF中SOX4的表達(dá)量明顯高于WT組小鼠，說明小鼠模型構(gòu)建成功。研究人員進(jìn)一步分析了8周齡小鼠棕色脂肪的表型，Pref1-Sox4組小鼠棕色脂肪的棕化程度高于其對照組（2 B），H＆E染色結(jié)果表明Pref1-Sox4組小鼠棕色脂肪的脂滴更小（2 C）。以上結(jié)果表明SOX4能抑制棕色脂肪的白化。

過表達(dá)SOX4抑制了棕色脂肪白化

（A）WT組小鼠和Pref1-Sox4組小鼠（8周，雄鼠）BAT SVF中SOX4的表達(dá)量。（B-C）8周齡雄性的WT鼠和Pref1-Sox4鼠棕色脂肪組織的解剖圖（B），圖C為兩組小鼠棕色脂肪對應(yīng)的H＆E染色圖，標(biāo)尺為60 μm。

綜上所述研究人員得出以下結(jié)論：①SOX4是小鼠棕色脂肪發(fā)育過程中必不可少的元件。②SOX4可能參與小鼠棕色脂肪生理狀態(tài)的維持。

2 SOX4的過表達(dá)促進(jìn)了小鼠的產(chǎn)熱能力
為探究SOX4對棕色脂肪產(chǎn)熱功能的影響，研究人員比較了WT組與Pref1-Sox4組小鼠的體溫和代謝指標(biāo)。如圖3A-B，出生后1天的Pref1-Sox4組小鼠表面溫度（32 ℃）顯著高于WT組（28.2 ℃）。在8周齡時，常溫下兩組小鼠體溫?zé)o明顯差異；但急劇冷刺激下，Pref1-Sox4組在第4小時體溫降至最低，隨后回升至37 ℃，而WT組降至35.5 ℃(圖3C)。冷刺激后，Pref1-Sox4組血糖較低，且其棕色脂肪的TG含量在常溫及冷刺激條件下均低于WT組 (圖3D-E)。此外，在冷刺激下，Pref1-Sox4組的產(chǎn)熱顯著高于對照組(圖3F)。這些結(jié)果表明，SOX4的過表達(dá)增強(qiáng)了棕色脂肪的產(chǎn)熱功能及冷刺激下的代謝水平。

SOX4促進(jìn)棕色脂肪的產(chǎn)熱能力

（A）出生后一天的WT和Pref1-Sox4小鼠（雄鼠）的熱成像圖（A），其熱成像的量化圖為（B），n=3。（C）取8周齡的雄性小鼠，單籠飼養(yǎng)一周再饑餓4 h后，一組放在常溫，檢測其6小時以內(nèi)的體溫變化，n=7-8；一組直接轉(zhuǎn)移到4 ℃冷房，在冷刺激的第0 h，第1 h，第2 h，第3 h，第4 h，第5 h，第6 h檢測其直腸溫度，n=4-6。（D）體溫采集實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，尾靜脈取血檢測其血糖水平，n=5。（E）將小鼠安樂死后，取棕色脂肪組織檢測TG含量，n=5。（F）將9周齡雄性小鼠的生存溫度從22 °C降低至4 °C，檢測其熱量產(chǎn)生，n=6。

3 SOX4促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞的分化
為了進(jìn)一步確認(rèn)SOX4的過表達(dá)能否促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞的分化，研究人員又從WT小鼠和Pref1-Sox4過表達(dá)小鼠的棕色脂肪組織中分離了BAT SVF細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)（圖4 A）。如圖4 B所示，過表達(dá)組細(xì)胞的脂滴囤積明顯少于對照組細(xì)胞，TG含量檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明SOX4的過表達(dá)能明顯降低細(xì)胞內(nèi)TG的含量（圖4 C）。研究人員還進(jìn)一步探究了SOX4的過表達(dá)對產(chǎn)熱基因的影響，如圖4 D所示，SOX4的過表達(dá)明顯促進(jìn)了Ucp1、Pgc1α、Prdm16、Pparα和Dio2等產(chǎn)熱基因的表達(dá)，但是SOX4的過表達(dá)并不會影響白色選擇性基因Retn和Agt的表達(dá)水平，僅僅會使Lyz2的表達(dá)水平輕微下調(diào)。如圖4 E所示，SOX4的過表達(dá)能促進(jìn)PGC1-α、UCP1和PRDM16等蛋白的表達(dá)。最后研究人員還提取了兩組細(xì)胞的DNA，檢測了Nd1、Nd2和Nd4的表達(dá)水平。如圖4 F所示，SOX4的過表達(dá)并沒有改變Nd1、Nd2和Nd4的表達(dá)水平，說明SOX4的過表達(dá)并沒有促進(jìn)線粒體合成。
 

SOX4促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞的分化

（A-C）從WT小鼠和Pref1-Sox4過表達(dá)小鼠（雄鼠，3周齡）的棕色脂肪組織中分離BAT SVF細(xì)胞直接進(jìn)行體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如圖A所示。在誘導(dǎo)后的第7天，進(jìn)行油紅染色實(shí)驗(yàn)（B）和TG含量測定實(shí)驗(yàn)（C），標(biāo)尺長度為100 μm。(D) 在誘導(dǎo)后的第7天，RT-PCR檢測Ucp1、Pgc1α、Prdm16和Dio2等產(chǎn)熱基因的mRNA水平以及白色選擇性基因的mRNA水平。（E）兩組細(xì)胞產(chǎn)熱相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。（F）提取兩組細(xì)胞的DNA，RT-PCR檢測線粒體數(shù)量相關(guān)基因（Nd1、Nd2和Nd4）的表達(dá)。

4 在棕色脂肪細(xì)胞分化過程中SOX4激活EBF2的表達(dá)
為了進(jìn)一步探究SOX4調(diào)控棕色脂肪早期發(fā)育的機(jī)制，研究人員利用敲低Sox4的BAT SVF細(xì)胞以及其對照細(xì)胞進(jìn)行時間點(diǎn)收樣實(shí)驗(yàn)。如圖5A-B所示，SOX4的缺失完全抑制了Ebf2的表達(dá)。進(jìn)一步的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，Ebf2的過表達(dá)能有效抑制TG的累積，有效抑制了產(chǎn)熱基因的下調(diào)（圖5C-D)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，SOX4可以與EBF2形成復(fù)合體，兩者共同促進(jìn)Ebf的轉(zhuǎn)錄激活。以上結(jié)果表明，SOX4一方面可以作為Sox4的下游，促進(jìn)產(chǎn)熱基因的表達(dá)，另一方面，兩者還能互相結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，共同促進(jìn)Ebf2的轉(zhuǎn)錄。
 

SOX4與EBF2協(xié)同促進(jìn)Ebf2的表達(dá)

在加入誘導(dǎo)劑后的第0天、第2天、第4天和第6天分別收細(xì)胞，通過RT-PCR檢測調(diào)控棕色脂肪發(fā)育早期，中期和晚期轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平。（B）對對照組細(xì)胞和敲低組細(xì)胞進(jìn)行棕色化誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)的第0 h，第1 h，第2 h，第8 h，第12 h進(jìn)行定點(diǎn)收樣，用RT-PCR檢測特定的基因。（C-D）在BAT SVF細(xì)胞中，先用慢病毒將Sox4敲低，再慢病毒過表達(dá)Ebf2，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系后進(jìn)行棕色化誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)后的第7天，分別檢測細(xì)胞的TG水平和產(chǎn)熱基因的mRNA水平。（E-G）內(nèi)源IP、外援IP和免疫熒光證明SOX4與EBF2相互結(jié)合。（H）在NIH3T3細(xì)胞中，分別過表達(dá)SOX4, EBF2，或同時過表達(dá)SOX4和EBF2,分別檢測對EBF2的轉(zhuǎn)錄激活情況。

總結(jié)
在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)SOX4對BAT的發(fā)育和產(chǎn)熱程序是必需的。在BAT前體細(xì)胞（Sox4-MKO）或褐色脂肪細(xì)胞（Sox4-BKO）中缺乏SOX4會導(dǎo)致褐色脂肪白化，并在急性冷暴露下出現(xiàn)低溫癥。Sox4-MKO小鼠的產(chǎn)熱能力降低，使其對飲食誘導(dǎo)的肥胖更易感。相反，在BAT中過表達(dá)SOX4可以增強(qiáng)產(chǎn)熱能力，對抗飲食誘導(dǎo)的肥胖。從機(jī)制上講，SOX4激活EBF2的轉(zhuǎn)錄，而EBF2決定了褐色脂肪的命運(yùn)。此外，SOX4在S235位點(diǎn)的磷酸化通過PKA促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位和EBF2轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步地，SOX4與EBF2結(jié)合，激活調(diào)控產(chǎn)熱基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄程序。這些結(jié)果表明SOX4作為EBF2的上游調(diào)節(jié)因子，為BAT的發(fā)育和產(chǎn)熱功能的維持提供了寶貴的見解（圖6）。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中仍需解決一些問題。研究人員的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，SOX4對于棕色脂肪細(xì)胞的分化是必需的。為了進(jìn)一步分析SOX4在確定棕色脂肪細(xì)胞命運(yùn)中的作用，未來需要確認(rèn)譜系追蹤研究。此外，SOX4的磷酸化如何介導(dǎo)其核轉(zhuǎn)位并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性仍不清楚。

本文的研究模式圖

參考文獻(xiàn)
Wang S, He T, Lu Y, et al. SOX4 facilitates brown fat development and maintenance through EBF2-mediated thermogenic gene program in mice [J]. Cell Death Differ 2024: https://doi.org/10.1038/s41418-024-01397-0.