通常，細胞或組織中的特異性 Marker 意味著啟動子的活性在這種細胞類型中相對較高，而并非在其他細胞中完全不表達。在其他細胞中，目的啟動子也可能被弱激活，這種現象也被叫做異位表達。異位表達對譜系追蹤的影響很大，常常會導致一些關于細胞命運的爭議。

圖. 異位表達對譜系示蹤的影響^[1]

為了更精準的標記特定細胞類型，避免異位表達的影響，我們可以借助兩個（甚至以上）的 Marker 進行標記，那么在小鼠中利用多個 Marker 標記時，我們就涉及到了使用多種重組酶與報告基因小鼠。

譜系示蹤系類課程往期回顧：
【譜系示蹤系列第一期】基礎細胞標記方式
【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導的多色報告系統方法
【譜系示蹤系列第三期】多重組酶介導的交叉報告基因方法
譜系示蹤的難點——基因標記的異位表達如何避免？（上） 
譜系示蹤的難點——基因標記的異位表達如何避免？（中）

前幾期，我們為大家講述的幾種避免基因異位表達的系統均是針對報告基因小鼠進行相應改造，利用報告基因小鼠上的多對重組位點與報告基因的交錯排列來實現標記不同細胞類型的目的。那么，是否存在針對重組酶設計的系統呢？

roxCre遺傳策略

roxCre 是將 rox-Stop-rox（RSR）插入 Cre 編碼區前或編碼區中，在移除 Stop 序列之前，Cre 無法正確進行轉錄和翻譯。將該小鼠與另一個 Marker 基因啟動的 Dre 小鼠進行交配后，Dre 介導 RSR 之間發生重組將 Stop 序列去除后，該 Cre 才能正常發揮功能。

圖. roxCre 小鼠的兩種類型

有同學會提問，當 RSR 插入 Cre 編碼區時，即使通過 Dre-rox 重組去除 RSR 后，在其編碼序列中會包含一個剩余的 rox 位點，這個位點是否會影響 Cre 的重組效率呢？
 

中科院周斌團隊對此進行了相關研究，研究者在 Cre 的12個不同位點分別插入了 rox 序列，其中大部分位于螺旋結構域之間。由于插入額外的 rox 氨基酸會改變 Cre 的原始序列，他們將這種包含剩余 rox 位點的 Cre 稱為 mCre。研究者通過通過用12個版本的 mCre（mCre1~mCre12）和響應的GFP報告基因轉染細胞來篩選它們的重組效率。結果證明，mCre1、2、3、4、6、7、10和11的效率與傳統Cre相當。說明通過合適的插入位點設計，包含 rox 位點的 Cre 與 普通 Cre 的重組效率可保持一致。
 

圖. 12種不同插入位點的mCre小鼠的重組效率檢測^[2]

那么，這種 roxCre 遺傳策略如何幫助我們精確標記細胞群呢？

若我們想標記 A⁺B⁺ 細胞，我們就可以利用啟動子 A 介導的 roxCre 小鼠、啟動子 B 驅動的 Dre 小鼠、以及 LSL-Reporter 小鼠進行交配：
 

圖. roxCre 小鼠的基因重組圖解

1 A⁺B^- 細胞或A^-B⁺ 細胞：
僅 makerA 表達時，Cre 由于RSR的存在而無法正確進行轉錄和翻譯，該類型細胞無法被標記。僅makerB 表達時，Dre 酶 無法重組 Loxp 位點，細胞無法被標記。

2 A⁺B⁺ 細胞：
makerB 介導 Dre 表達，Dre 酶會切除 roxCre 系統中兩個 Rox 位點之間的 stop 序列。makerA 可介導 Cre 酶表達，Cre 酶重組報告小鼠的 Loxp 位點，去除 LSL 中的Stop序列。因此，該類型細胞被 Reporter 基因標記。

案例1

損傷后出現的過多的心肌成纖維細胞是組織纖維化的關鍵因素。經前期研究，心肌成纖維細胞主要來源于心外膜與心內膜。由于心內膜細胞與心外膜細胞功能上的差異，研究者懷疑來自不同來源的成纖維細胞在心臟纖維化期間可能表現出不同的功能。為探索這一問題，研究者首先需準確標記不同來源的心肌成纖維細胞。

以心內膜衍生成纖維細胞為例，研究者利用了心內膜細胞marker Col1a2 與成纖維細胞 marker Nfatc1，構建了以下小鼠：Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP。
 

圖. Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP小鼠的基因重組圖解^[3]

關于 Col1a2-RSR-CreER，激活 CreER 需要 Dre 和 TAM 兩者共同存在。因此，在 TAM 誘導下，該小鼠可以標記 Col1a2 與 Nfatc1 雙陽性細胞，即心內膜衍生成纖維細胞。

圖. 使用roxCreER準確標記心內膜衍生成纖維細胞^[3]

除上述通過加入 Stop 序列來調控 Cre 酶的活性的 roxCre 遺傳策略外，還有另一種思路，同樣也可以達到使用一種重組酶，調控另一種重組酶重組活性的策略。那就是 CrexER 遺傳策略。

CrexER 遺傳策略

CrexER 策略是通過將兩個 rox 位點插入到 CreER cDNA 的雌激素受體編碼區的兩側，形成了可切換的 CreER 重組酶。由于 ER 的影響，在理想情況下，Cre-ER 蛋白是位于細胞質的，無法入核發揮重組酶活性，而將該小鼠與另一個 Marker 基因啟動的 Dre 小鼠進行交配后，Dre 介導 RSR 之間的重組并將ER區去除，該 Cre 即可正常發揮功能。

圖. CrexER小鼠的基因重組圖解^[4]

與前一套遺傳策略相似，CrexER 遺傳策略同樣適用于標記 A⁺B⁺ 細胞。

案例2
據報道，間皮細胞標志物 Wt1 在發育中的冠狀動脈血管中表達，但在其他血管中不表達，并且Wt1-CreER 小鼠可標記心外膜細胞與胚胎心臟中的冠狀動脈內皮細胞。而第二個標記物 Tie2 是泛內皮細胞標記物，在大多數血管以及某些髓系細胞群中表達。

研究者關注的是冠狀動脈內皮細胞，因而他們構建了以下的小鼠：Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato。
 

圖. Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato 小鼠的基因重組圖解^[4]

利用 CrexER 系統，他們精準標記到了 Wt1 和 Tie2 的雙陽性的細胞群，經過檢測，被標記為紅色的細胞群中致密心肌中內皮細胞占比 97.15%±0.61%。

圖. 使用 CrexER 準確標記心肌中內皮細胞^[4].

CDH3 為心肌內皮細胞的另一 Marker。圖中紅色（CrexER 策略）與綠色（CDH3 標記）信號基本一致。

上述講述的兩種對重組酶的改造方案，可標記的細胞類型均為A⁺B⁺ 細胞群。下面介紹一種可標記A⁺B^- 細胞的重組酶改造方式。

dCreER 遺傳策略

dCreER 策略是通過將兩個 rox 位點插入到 CreER 整體編碼區的兩側，整段 CreER 均可以被 Dre 重組酶刪除。由于這樣的設計，因而導致當 Dre 酶不存在時，CreER 正常表達行使功能，當 Dre 酶存在時，CreER 序列被剪切，無法進行表達或翻譯。
 

圖. dCreER 小鼠的基因重組圖解

如上圖所示，dCreER 遺傳策略適用于標記 A⁺B^- 細胞。

案例3
哺乳動物的脂肪組織有兩種不同類型：WAT 和 BAT。目前沒有很好的標記 WAT 的 marker，主要方式還是依靠泛脂肪 marker PLIN1，而 BAT 可以使用棕色脂肪組織 marker UCP1 進行標記。

因而研究者利用 dCreER 遺傳策略，構建了 Plin1-dCreER;Ucp1-Dre;R26-tdTomato 小鼠（下述將 Plin1-dCreER;Ucp1-Dre 交配小鼠稱為 WA-iCre 小鼠）
 

圖. WA-iCre;R26-tdTomato 小鼠的基因重組圖解^[5]

在 WAT 中，PLIN1 正常表達，UCP1 不表達，因而在 TAM 的作用下，細胞被標記為紅色；在 BAT 中，UCP1 表達，進而 Dre 介導兩個 Rox 位點發生重組，PLIN1 之后的 CreER 酶被去除，導致細胞無法被標記上顏色。
 

圖. 使用 dCreER 準確標記 WAT 細胞^[5]

以上是在譜系示蹤中對重組酶的幾種改造方案，經過改造后，一種重組酶的活性可受到另一種重組酶的調控，這種制約關系可幫助我們精準地標記目的細胞。

關于譜系示蹤的各類工具介紹已經講述完畢，雖然涉及的類型非常多，應用也較為繁瑣，但可以幫助我們快速檢索目的細胞，明確細胞命運。最后一期，我們將對前面講述的的各類工具進行一個梳理，并為您介紹這些工具相互連用的進階案例，大家敬請期待~

Reference：
[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, CAI D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.
[2] Shi Mengyang, Li Jie, Liu Xiuxiu, Liu Kuo, Pu Wenjuan, Weng Wendong, Zhang Shaohua, Zhao Huan, Lui Kathy O., Zhou Bin (2024) The robust, high-throughput, and temporally regulated roxCre and loxCre reporting systems for genetic modifications in vivo eLife 13:RP97717 https://doi.org/10.7554/eLife.97717.1
[3] Han, M., Liu, Z., Liu, L. et al. Dual genetic tracing reveals a unique fibroblast subpopulation modulating cardiac fibrosis. Nat Genet 55, 665–678 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01337-7
[4] Pu W, He L, Han X, Tian X, Li Y, Zhang H, Liu Q, Huang X, Zhang L, Wang QD, Yu Z, Yang X, Smart N, Zhou B. Genetic Targeting of Organ-Specific Blood Vessels. Circ Res. 2018 Jun 22;123(1):86-99. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.118.312981. Epub 2018 May 15. PMID: 29764841; PMCID: PMC6015762.
[5] Han X, Zhang Z, He L, Zhu H, Li Y, Pu W, Han M, Zhao H, Liu K, Li Y, Huang X, Zhang M, Jin H, Lv Z, Tang J, Wang J, Sun R, Fei J, Tian X, Duan S, Wang QD, Wang L, He B, Zhou B. A suite of new Dre recombinase drivers markedly expands the ability to perform intersectional genetic targeting. Cell Stem Cell. 2021 Jun 3;28(6):1160-1176.e7. doi: 10.1016/j.stem.2021.01.007. Epub 2021 Feb 9. PMID: 33567267.

上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領域，打造了以基因修飾動物模型研發為核心，涵蓋多物種模型構建、飼養繁育、表型分析、藥物臨床前評價等多個技術平臺，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產品解決方案。