文章來源公眾號：華人抗體 作者：小藥說藥 引言
幾十年來，抗體偶聯藥物（ADC）和生物偶聯物的進步徹底改變了各種疾病的靶向治療。與傳統的化療不同，ADC選擇性地靶向腫瘤細胞，同時保留正常細胞，使其非常適合癌癥治療。目前，全球市場上已有17種ADC獲得不同國家監管機構的批準。臨床試驗中有超過200多個ADC正在探索，預計未來幾年還有更多ADC商業化，使癌癥患者受益。 ADC設計中的多種因素影響其成功，包括抗體、接頭、有效載荷選擇、藥物附著位點和藥物抗體比（DAR），所有這些因素都起著重要作用。藥物附著在抗體上的方法至關重要；藥物連接的位置和方式會影響ADC的穩定性、療效和藥代動力學（PK）。



偶聯方法傳統上分為兩類：隨機偶聯和位點特異性偶聯。進一步，可以將這些技術分為三類。第一類是隨機偶聯（例如隨機賴氨酸）。第二類是位點特異性的，但不是位點選擇性的，因為這些位點受到所使用的偶聯技術的限制。這一類別包括酶、聚糖、親和肽偶聯和“隨機”鏈間半胱氨酸偶聯。第三類是位點特異性和位點選擇性，修飾氨基酸序列，如工程半胱氨酸或非天然氨基酸，提供各種結合位點。關于CMC，隨機偶聯和鏈間半胱氨酸偶聯通常更簡單。位點特異性和位點選擇性偶聯技術提供了更好的同質性，但可能會遇到更多的CMC挑戰，包括蛋白質表達問題（如非天然氨基酸）、去除雜質所需的額外純化步驟（如酶）以及額外的分析和質量控制挑戰（如DAR分布）。 一、隨機偶聯 賴氨酸偶聯是一種成熟的生產ADC的技術，利用賴氨酸殘基上約40個溶劑可及的NH2基團，這些基團在中性溶液中具有高度的親核性。親電試劑主要針對這些氨基，允許接頭有效載荷附著而不改變抗體本身。迄今為止，五種市售ADC證明了賴氨酸偶聯的功效。受到這一成功的鼓舞，已經開發了一系列更廣泛的連接子，包括N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）及其類似物、苯甲酰氟、異硫氰酸酯和方酸甲酯。 然而，由于這些連接子與雜原子具有高度反應性，因此它們也可以在水中淬滅。事實上，NHS酯的水解是影響賴氨酸偶聯中linker-payload（LP）當量的關鍵因素之一。此外，反應性較低的連接子可以在溫和的條件下與半胱氨酸的-SH殘基反應，在這種條件下，與賴氨酸的反應很慢。 總的來說，賴氨酸偶聯仍然是生產ADC的可靠方法，可以產生化學穩定和可重復的產品。此外，位點特異性結合技術的發展繼續增強了其更好的同質性的潛力。 二、位點特異性但非位點選擇性偶聯 鏈間半胱氨酸偶聯
通常，IgG1抗體在溶劑暴露區域含有四對鏈間二硫鍵。使用還原劑如三（2-羧乙基）膦（TCEP）和DL-二硫蘇糖醇（DTT）還原后，可以獲得八種游離硫醇。與賴氨酸殘基上的SN2反應相比，硫醇作為親核試劑更柔軟，更容易發生邁克爾加成反應。這種特性允許馬來酰亞胺及其類似物用作連接子，從而能夠形成清潔且幾乎定量的巰基丁二酰亞胺。這種生物正交化學非常適合抗體修飾，產生具有0、2、4、6和8個有效載荷的變體。 由于巰基較少，半胱氨酸介導的ADC異質性遠低于賴氨酸方法。與其他偶聯方法相比，馬來酰亞胺偶聯物因其簡單、可控條件和高產率而脫穎而出。迄今為止，馬來酰亞胺與減少的鏈間二硫化物結合仍然是ADC構建的主要方法。在15個具有強效毒性有效載荷的商業化ADC中，有10個以及大多數處于臨床階段的ADC都使用了馬來酰亞胺偶聯技術。



馬來酰亞胺-硫醇偶聯物易于逆轉邁克爾加成反應，導致通過血清蛋白相互作用過早釋放有效載荷。這種逆邁克爾加成反應會影響ADC在血漿中的穩定性，降低其有效性和安全性。為了解決這個問題，科學家們探索了幾種策略，包括通過引入額外的基團如N-芳基和鄰氨基來催化馬來酰亞胺的水解，或者用開環馬來酰亞胺甲酯代替馬來酰亞胺，以避免逆邁克爾加成反應。此外，新型連接體如KTHIOL?、P5?和溴乙酰氨基癸酰基已顯示出增強的硫醇選擇性和對逆邁克爾加成反應的抗性。 酶標簽偶聯
酶偶聯涉及通過利用識別特定氨基酸序列的酶將有效載荷直接附著到抗體上。該技術在ADC中提供了高均一性，展示了其作為有效偶聯方法的潛力。許多酶需要序列工程和抗體等底物的結構適應性。臨床上使用的酶包括Sortase A（SrtA），這是一種30 kDa的轉肽酶，可以切割LPXTG序列形成硫酯酰基酶中間體，使肽LPXT轉移到底物的N端。值得注意的例子包括NBE-002（SMAC Technology?），目前處于1/2期試驗階段。 另一個是甲酰甘氨酸生成酶，它附著在CXPXR序列上，將半胱氨酸轉化為甲酰甘氨酸，使用這種偶聯方法的ADC如TRPH-222（SMARtag?），目前處于1期臨床階段。法尼烷基轉移酶通過在CaaX標簽內的半胱氨酸殘基上添加類異戊二烯基團來修飾抗體，這類的ADC如FS-1502（ConjuAll?）目前處于III期臨床階段。還有一些酶，如微生物轉谷氨酰胺酶（mTG），靶向抗體上的天然位點，如Q295位點，催化谷氨酰胺的γ-羧酰胺與有效載荷的游離胺基之間形成酰胺鍵，代表性分子如DP303，目前處于III期臨床。此外，一些處于臨床前研究階段的ADC使用的酶包括肽天冬酰胺基連接酶、微管蛋白酪氨酸連接酶、胰蛋白酶、磷酸泛乙烯基轉移酶、SpyLigase和O6烷基胍DNA烷基轉移酶。 酶偶聯過程通常比傳統技術更復雜，需要更廣泛的材料和更復雜的步驟，這會顯著影響生產成本和成功的可能性。此外，與傳統的偶聯相比，酶偶聯引入了額外的成分，如結合酶、輔因子和表達相關雜質，所有這些都具有潛在的免疫原性。需要采取額外的措施來消除最終產品中的催化酶和污染物。總的來說，酶偶聯是一種強大的位點特異性技術，在臨床前和臨床階段取得了許多成功。下一代酶偶聯技術可以通過技術更新和優化CMC工藝來提高產品的均一性。 聚糖重塑偶聯
近十年來，糖偶聯引起了學術界和工業界的極大興趣。雖然大多數乙二醇偶聯方法仍然依賴于酶來促進偶聯過程，但它們不需要氨基酸序列工程。早期的技術涉及使用高碘酸鈉（NAIO4）氧化聚糖上的順式二醇，為隨后的修飾創造醛基。最近的策略強調聚糖重塑，其中天然聚糖（附著在N297位點）被修飾或替換為新的聚糖，然后可以與功能性連接子或連接子-載荷復合物連接。
Synaffix的GlycoConnect?技術使用內切糖苷酶來修剪天然聚糖異構體，然后添加疊氮修飾的半乳糖殘基和半乳糖基轉移酶。然后，這種修飾的聚糖通過帶有兼容手柄的點擊化學與有效載荷偶聯。這種方法在ADC開發中得到了廣泛的應用，有六個活躍的臨床階段項目使用了這種方法，包括IBI-343。然而，這個過程涉及至少兩種酶和三個偶聯步驟，這可能會使開發復雜化，降低產量，并增加CMC成本。 此外，從化膿性鏈球菌中發現的內糖苷酶EndoS和EndoS2，這些酶能夠水解IgG的N-聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯的有效位點，使靶分子能夠在一個偶聯步驟中附著到N297位點。這種方法有助于使單抗的聚糖結構均勻化，同時它也適用于任何IgG亞型。盡管尚未經過臨床驗證，但endo-S2方法因其降低的CMC成本而極具吸引力。 親和肽偶聯
親和定向偶聯使用來自蛋白A或G IgG結合位點的親和肽。該肽選擇性結合Fc區的特定位點，使其更接近某些賴氨酸殘基，并提高連接子和-NH2基團之間的反應速度。為了防止與其他反應性-NH2基團發生副反應，應使用溫和的連接子。典型的結合位點位于Fc區的K248/K288或K337殘基附近；雖然親和肽的序列修飾可以將結合位點轉移到Fab區，但這通常會導致結合效率降低。一些開創性的方法涉及用穩定的共價鍵將連接子偶聯到親和肽上，然后共價連接到抗體上形成ADC。然而，大型非天然肽可能通過阻礙FcRn結合來干擾Fc功能，從而可能減少ADC內化。 三、位點特異性和位點選擇性偶聯 工程化半胱氨酸隨機半胱氨酸偶聯和重橋接是利用抗體結構內天然存在的半胱氨酸殘基的技術。與它們不同的是，硫單抗技術通過利用不涉及結構二硫鍵的工程化反應性半胱氨酸，在抗體上實現所需位點的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設計是為了促進細胞毒性有效載荷偶聯的同時，保持單克隆抗體的穩定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術，包括計算建模、模型系統篩選和高通量掃描。 Junutula等人首先報道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸（HC-A114C），工程化位置內的反應性硫醇能夠與馬來酰亞胺負載的連接子反應。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現出效力，在大鼠和食蟹猴中表現出高劑量耐受性，這個發現建立了硫單抗偶聯策略的一般性方法。 下表詳細列出了臨床階段ADC中使用的工程化半胱氨酸位點。


非標準氨基酸
除了硫單抗技術外，非標準氨基酸（ncAA）的加入為位點特異性偶聯提供了另一種可能性。該技術使用含有獨特化學結構的氨基酸，從而能夠以化學選擇性的方式引入連接子-有效載荷復合物。該技術需要對抗體序列重組，利用與宿主細胞內所有內源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于響應未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質。通常，ncAA在發酵過程中被添加到培養基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因為它們可能激發免疫原性。常用的ncAA是具有獨特基團的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環丙烯或二烯。 已有研究將對乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯，從而生成化學均一的ADC。該ADC在小鼠體內表現出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。 由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動力學，另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應用的對疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理條件下快速進行CuAAC或SPAAC反應，利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯糖皮質激素有效載荷。除了pAcF技術外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點特異性ADC。 此外，賴氨酸的環丙烯衍生物（CypK）以及自然發生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進入抗體中。所產生的ADC表現出良好的穩定性、選擇性以及體外和體內活性。 結語 由于偶聯技術對ADC特性的廣泛影響，確定特定抗體/連接子-有效載荷組合的最佳偶聯位點和化學物質仍然是一個重大挑戰。這些影響包括結合、內化、有效載荷釋放、PK、效應器功能等。盡管一些新興的偶聯技術通常表現出更好的療效和安全性，但臨床前和臨床研究之間的轉化經常存在差距。此外，即使整個過程看起來更簡單，新的偶聯技術也會在CMC過程中帶來意想不到的挑戰。隨著我們對ADC復雜性的理解加深，以及我們從更多采用先進偶聯方法的ADC中積累臨床數據，預計將出現新的、更合適的偶聯技術。這些技術進步將進一步解決未滿足的臨床需求。