Pipetty電動移液器在豬藍耳病毒檢測（實時RT-PCR）中的應用_abio生物試劑品牌網
方案摘要：豬繁殖與呼吸綜合征，是由病毒（PRRSV）感染豬引起的一種高度傳染性疫病，臨床表現為母豬繁殖系統障礙，斷奶仔豬消瘦、生長遲緩以及死亡率增加。該病能引起豬體溫升高、呼吸困難，導致豬耳朵發紺，又稱藍耳病，為提升豬藍耳病毒 實時RT-PCR 檢測效率與準確性，PIpetty 電動移液器憑借核心優勢適配全流程需求，配合溫度補償，可減少手部溫度導致的移液波動，保障試劑添加精準，降低假陰性風險，為豬藍耳病防控提供可靠支撐。
方案詳情：
一、實驗原理
實時RT-PCR 檢測豬藍耳病（PRRS），核心是針對豬藍耳病病毒（PRRSV，RNA 病毒）的實時 RT-PCR 技術：先通過逆轉錄將病毒 RNA 轉為可擴增的 cDNA，再經 PCR 循環（變性、退火、延伸）使病毒靶序列指數級增長；過程中利用熒光物質（如 TaqMan 探針）實時監測，熒光信號隨靶序列增加同步增強；最終以熒光達閾值的循環數（Ct 值）判斷 —Ct 值越小病毒量越高，結合陰 / 陽性對照，實現對病毒的特異定量檢測。
二、? 實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 熒光PCR 儀；
③ 高速臺式冷凍離心機（4 ℃，離心速度 12 000 r/min 以上）；
④ 混勻器；
⑤ 冰箱（2℃~8 ℃、-20 ℃和-70 ℃）；
2、試劑和材料
① 商品化的 RNA 提取裂解液；
② 三氯甲烷；
③ 異丙醇（-20 ℃預冷）；
④ DEPC 水；
⑤ 75%乙醇；
⑥ dNTPS（含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 10 mmol/L）；
⑦ RT-PCR 反轉錄系統：AMV或 M-MLV反轉錄酶、Taq酶；
⑧ PRRSV-1 實時 RT-PCR 引物與探針序列
引物與探針序列根據 GenBank 中歐洲株 ORF6/ORF7 保守區域序列設計,引物的序列為：
上游引物 P1：5'-CAGATGCAGAYTGTGTTGCCT-3'；
下游引物 P2：5'-TGGAGDCCTGCAGCACTTTC-3'；
探針序列 P3：5'-(FAM)ATACATTCTGGCCCCTGCCCAYCACGT(TAMRA)-3'；
⑨ PRRSV-2 實時 RT-PCR 引物與探針序列
引物與探針序列根據 GenBank 內美洲株 ORF7/3'UTR 保守區域序列設計,引物的序列為：
上游引物 P1：5'-GCACTGATTGACAYTGTGCC-3'；
下游引物 P2：5'-CGCATGGTTCTCGCCAAT-3'；
探針序列 P3：5'-(FAM)AGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCG(TAMRA)-3'。
三、實驗步驟
1、樣本總 RNA 的提取
a） 取滅菌的 1.5 mL離心管，基于樣本數量進行編號。每管加入 600 μL 細胞裂解液，使用Pipetty電動移液器，設置連續分液功能，然后分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照、空白對照（無核酸酶水）各 200μL，每加完一個試劑換用一個吸頭，再各加入 200 μL 三氯甲烷，在混勻器上振蕩混勻5 s。于4 ℃經 12 000 r/min 離心 15 min。
b） 取相同數量滅菌的 1.5 mL離心管，加入 500μL異丙醇。吸取各管中的上清液（至少 500 μL）轉移至相應的管中，并顛倒混勻。
c） 于4 ℃經 12 000 r/min 離心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體，然后加入600 μL 75%乙醇進行洗滌。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體。
e） 64 000 r/min 離心 10 s，將管壁上的殘余液體甩至管底部，用微量移液器吸干液體，室溫干燥3 min。
f） 使用Pipetty連續分液模式，加入 11 μL DEPC水，混勻模式，自動混勻，以溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心5s，置于冰上備用。提取的 RNA 應在 2h內進行 RT-PCR 擴增，否則應置于-70 ℃冰箱保存。
2、分別使用引物和探針，檢測 PRRSV-1 和 PRRSV-2。實時 RT-PCR 反應體系見表 3。設置混勻模式，將各種試劑充分混勻，2 000 r/min 離心 2 min。將 15 μL 實時 RT-PCR 反應混合液加入 PCR 反應管，然后加入 10 μL樣本 RNA 模板，密封反應管，500 r/min 離心30s。將所有檢測樣本的PCR 管放入熒光 PCR 儀中。每次進行實時 RT-PCR 檢測均應設陽性對照、陰性對照及空白對照。
3、反轉錄，42 ℃（AMV）或 50 ℃（M-MLV）30 min；預變性，92 ℃ 3 min；預擴增，92 ℃ 變性 10 s，45 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，5 個循環；擴增，92 ℃變性 10 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，40 個循環。在擴增階段每次循環的 60 ℃ 退火延伸時收集熒光信號。
四、結果判定
1、試驗成立條件：陽性對照的 Ct 值應<28 且出現特異性擴增曲線，陰性對照應無 Ct 值或Ct 值≥40 且無特異性擴增曲線，試驗結果有效，否則，應重新進行試驗。
2、被檢樣本 Ct 值≤30 且出現特異性擴增曲線，判為陽性；當無 Ct 值或 Ct值≥40，判為陰性；當30
方案詳情：
一、實驗原理
實時RT-PCR 檢測豬藍耳病（PRRS），核心是針對豬藍耳病病毒（PRRSV，RNA 病毒）的實時 RT-PCR 技術：先通過逆轉錄將病毒 RNA 轉為可擴增的 cDNA，再經 PCR 循環（變性、退火、延伸）使病毒靶序列指數級增長；過程中利用熒光物質（如 TaqMan 探針）實時監測，熒光信號隨靶序列增加同步增強；最終以熒光達閾值的循環數（Ct 值）判斷 —Ct 值越小病毒量越高，結合陰 / 陽性對照，實現對病毒的特異定量檢測。
二、? 實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 熒光PCR 儀；
③ 高速臺式冷凍離心機（4 ℃，離心速度 12 000 r/min 以上）；
④ 混勻器；
⑤ 冰箱（2℃~8 ℃、-20 ℃和-70 ℃）；
2、試劑和材料
① 商品化的 RNA 提取裂解液；
② 三氯甲烷；
③ 異丙醇（-20 ℃預冷）；
④ DEPC 水；
⑤ 75%乙醇；
⑥ dNTPS（含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 10 mmol/L）；
⑦ RT-PCR 反轉錄系統：AMV或 M-MLV反轉錄酶、Taq酶；
⑧ PRRSV-1 實時 RT-PCR 引物與探針序列
引物與探針序列根據 GenBank 中歐洲株 ORF6/ORF7 保守區域序列設計,引物的序列為：
上游引物 P1：5'-CAGATGCAGAYTGTGTTGCCT-3'；
下游引物 P2：5'-TGGAGDCCTGCAGCACTTTC-3'；
探針序列 P3：5'-(FAM)ATACATTCTGGCCCCTGCCCAYCACGT(TAMRA)-3'；
⑨ PRRSV-2 實時 RT-PCR 引物與探針序列
引物與探針序列根據 GenBank 內美洲株 ORF7/3'UTR 保守區域序列設計,引物的序列為：
上游引物 P1：5'-GCACTGATTGACAYTGTGCC-3'；
下游引物 P2：5'-CGCATGGTTCTCGCCAAT-3'；
探針序列 P3：5'-(FAM)AGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCG(TAMRA)-3'。
三、實驗步驟
1、樣本總 RNA 的提取
a） 取滅菌的 1.5 mL離心管，基于樣本數量進行編號。每管加入 600 μL 細胞裂解液，使用Pipetty電動移液器，設置連續分液功能，然后分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照、空白對照（無核酸酶水）各 200μL，每加完一個試劑換用一個吸頭，再各加入 200 μL 三氯甲烷，在混勻器上振蕩混勻5 s。于4 ℃經 12 000 r/min 離心 15 min。
b） 取相同數量滅菌的 1.5 mL離心管，加入 500μL異丙醇。吸取各管中的上清液（至少 500 μL）轉移至相應的管中，并顛倒混勻。
c） 于4 ℃經 12 000 r/min 離心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體，然后加入600 μL 75%乙醇進行洗滌。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體。
e） 64 000 r/min 離心 10 s，將管壁上的殘余液體甩至管底部，用微量移液器吸干液體，室溫干燥3 min。
f） 使用Pipetty連續分液模式，加入 11 μL DEPC水，混勻模式，自動混勻，以溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心5s，置于冰上備用。提取的 RNA 應在 2h內進行 RT-PCR 擴增，否則應置于-70 ℃冰箱保存。
2、分別使用引物和探針，檢測 PRRSV-1 和 PRRSV-2。實時 RT-PCR 反應體系見表 3。設置混勻模式，將各種試劑充分混勻，2 000 r/min 離心 2 min。將 15 μL 實時 RT-PCR 反應混合液加入 PCR 反應管，然后加入 10 μL樣本 RNA 模板，密封反應管，500 r/min 離心30s。將所有檢測樣本的PCR 管放入熒光 PCR 儀中。每次進行實時 RT-PCR 檢測均應設陽性對照、陰性對照及空白對照。
3、反轉錄，42 ℃（AMV）或 50 ℃（M-MLV）30 min；預變性，92 ℃ 3 min；預擴增，92 ℃ 變性 10 s，45 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，5 個循環；擴增，92 ℃變性 10 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，40 個循環。在擴增階段每次循環的 60 ℃ 退火延伸時收集熒光信號。
四、結果判定
1、試驗成立條件：陽性對照的 Ct 值應<28 且出現特異性擴增曲線，陰性對照應無 Ct 值或Ct 值≥40 且無特異性擴增曲線，試驗結果有效，否則，應重新進行試驗。
2、被檢樣本 Ct 值≤30 且出現特異性擴增曲線，判為陽性；當無 Ct 值或 Ct值≥40，判為陰性；當30
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