德克薩斯理工大學(xué)工業(yè)、制造和系統(tǒng)工程系Changxue Xu教授課題組使用MicroFab噴墨打印技術(shù)，通過液滴發(fā)生設(shè)備研究了生物打印過程中有/無墨水循環(huán)系統(tǒng)對生物墨水及打印結(jié)果中細(xì)胞分布的影響，實(shí)驗(yàn)表明，打印中墨水循環(huán)可明顯改善細(xì)胞聚集、使細(xì)胞分布均勻，打印后細(xì)胞均勻分布，在促進(jìn)細(xì)胞存活（培育3天從77%增到92%）和增殖（培育3天從1.7倍增到3.3倍）方面起關(guān)鍵作用，為組織/器官生物制造提供了重要支撐。

正文
增材制造技術(shù)的發(fā)展使得利用細(xì)胞和生物材料制造用于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的體外培養(yǎng)仿生器官成為可能，基于噴墨技術(shù)的生物打印可利用適用于大多數(shù)活細(xì)胞的噴嘴尺寸和打印分辨率，獲得高打印細(xì)胞存活率（＞90%），同時(shí)其非接觸打印、快速固化、高精度和自由曲面制造能力可用于制造復(fù)雜生物結(jié)構(gòu)，如皮膚、組織和血管模型。然而，墨水中細(xì)胞沉降及其聚集現(xiàn)象導(dǎo)致液滴不穩(wěn)定、噴嘴堵塞和打印分布不均一，嚴(yán)重影響打印的準(zhǔn)確度，因此，本文重點(diǎn)研究了生物打印中有/無生物墨水循環(huán)對微球和片狀結(jié)構(gòu)中細(xì)胞分布的影響，揭示了細(xì)胞聚集對打印后細(xì)胞分布以及增殖和細(xì)胞活力的不利影響，為提高生物噴墨打印的精度和可靠性提供了重要的依據(jù)，這對組織/器官生物制造起著至關(guān)重要的作用。

▲ 圖1 帶有生物墨水儲(chǔ)液器的噴墨生物打印裝置示意圖

如圖1，使用MicroFab波形發(fā)生器連接MJ噴墨噴頭（120μm）并向其發(fā)送信號，以產(chǎn)生生物墨滴。通過連接在生物墨水儲(chǔ)液罐底部和頂部的生物用硅膠管控制墨水循環(huán)，流速0.3ml/min，維持細(xì)胞分布均勻。
 

▲ 圖2 （a）噴墨打印的液滴生成過程（b）微球包載單個(gè)細(xì)胞、小細(xì)胞聚集體和大細(xì)胞聚集體圖，比例尺40μm

圖2展示了液滴生成過程及打印結(jié)果的代表圖像，噴墨頻率、噴墨噴嘴的移動(dòng)速度和移動(dòng)偏移之間進(jìn)行交叉優(yōu)化，以打印最佳的生物膜層。采用100Hz的噴墨頻率、200mm/min的移動(dòng)速度和100μm的移動(dòng)偏移來實(shí)現(xiàn)生物打印微球和生物打印線條之間的最佳融合。

▲ 圖3 在0.5%（w/v）NaAlg和1×106個(gè)細(xì)胞/ml的微球內(nèi)細(xì)胞分布和細(xì)胞聚集：（a）代表性圖像，（b）細(xì)胞分布，以及（c）細(xì)胞聚集。比例尺：100μm

圖3結(jié)果證明，有墨水循環(huán)系統(tǒng)時(shí)，生物打印微球內(nèi)細(xì)胞分布的均勻性得到改善，如圖3（a）所示，當(dāng)無墨水循環(huán)時(shí)，微球的平均細(xì)胞數(shù)增加到0.806，因?yàn)榧?xì)胞會(huì)沉降從而導(dǎo)致局部細(xì)胞濃度和細(xì)胞聚集增加；當(dāng)引入墨水循環(huán)時(shí)，平均細(xì)胞數(shù)從 0.255略微增加到0.305，這表明噴墨打印微球內(nèi)細(xì)胞分布的均勻性得到了顯著改善。如圖4所示，當(dāng)細(xì)胞濃度高時(shí)（5×106個(gè)細(xì)胞/ml），引入生物墨水循環(huán)也能抑制細(xì)胞的聚集，應(yīng)用生物墨水循環(huán)來促進(jìn)噴墨打印微球內(nèi)的細(xì)胞分布均勻性也適用于高細(xì)胞濃度。

▲ 圖4 在0.5%（w/v）NaAlg和5×106個(gè)細(xì)胞/ml的微球內(nèi)細(xì)胞分布和細(xì)胞聚集：（a）代表性圖像，（b）細(xì)胞分布，和（c）細(xì)胞聚集。比例尺：100μm

▲ 圖5 含有3T3小鼠成纖維細(xì)胞的生物打印片材內(nèi)細(xì)胞分布均勻性改善的結(jié)果：（a）生物打印片材（寬：0.5mm和高：1mm）和局部成像（比例尺：100μm）的代表性圖像及（b）統(tǒng)計(jì)結(jié)果

應(yīng)用生物墨水循環(huán)能提高生物打印片材內(nèi)細(xì)胞空間分布的均勻性，圖5（a）為生物打印片狀結(jié)構(gòu)中細(xì)胞分布的影響（隨機(jī)選擇面積為0.5×0.5mm的10個(gè)樣本）。圖 5（b）顯示了不同細(xì)胞濃度下生物打印片材的相應(yīng)細(xì)胞分布結(jié)果，當(dāng)無墨水循環(huán)時(shí)，低細(xì)胞濃度和高細(xì)胞濃度的高標(biāo)準(zhǔn)差反映了細(xì)胞聚集程度高、細(xì)胞分布不均勻，突出了解決細(xì)胞沉積和聚集問題的必要性。

▲ 圖6 孵育期有/無墨水循環(huán)對（a）細(xì)胞分布和（b）細(xì)胞活力的影響，（c）細(xì)胞縱橫比、（d）細(xì)胞分布比和（e）細(xì)胞活力的統(tǒng)計(jì)。比例尺：100μm

圖6展示了生物墨水循環(huán)對細(xì)胞分布及打印后細(xì)胞生長、增殖和活力的影響。均勻的細(xì)胞分布在細(xì)胞數(shù)量方面促進(jìn)細(xì)胞增殖，在5×106個(gè)細(xì)胞濃度、20min生物墨水循環(huán)下，細(xì)胞孵育三天的活力從95%下降到92%，相比之下，無墨水循環(huán)的細(xì)胞活力從96%降到77%。細(xì)胞死亡通常發(fā)生在大細(xì)胞聚集體的中心周圍，可能是由于外層細(xì)胞過厚阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交換，因此細(xì)胞聚集體嚴(yán)重影響生物打印質(zhì)量，生物墨水循環(huán)及噴墨打印技術(shù)結(jié)合，制備均勻的片狀結(jié)構(gòu)，改善了細(xì)胞分布，促進(jìn)細(xì)胞存活（培育3天從77%增到92%）和增殖（培育3天從1.7倍增到3.3倍）。

結(jié)語
本研究揭示了細(xì)胞聚集對噴墨生物打印中細(xì)胞分布及細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力的影響，并證實(shí)墨水循環(huán)系統(tǒng)可使細(xì)胞分布得到顯著改善，為提高噴墨生物打印技術(shù)的精度以及生物打印的活力提供了重要依據(jù)，這對組織/器官生物制造的成功起著至關(guān)重要的作用。

參考文獻(xiàn)：
[1] Liu J, Xu C. Improving uniformity of cell distribution in post-inkjet-based bioprinting[J]. Journal of Manufacturing Science and Engineering, 2024, 146(1): 014501.