不論你是否直接進行過基因操作，你一定聽說過Cre-lox系統。由于Cre-lox系統具有操作簡單、重組率高的優點，如今已經成為體內外遺傳操作的強有力工具。利用Cre-lox系統，可以在特定細胞、組織或整個生物體，甚至在特定時間點敲除或表達某個基因，實現對特定基因的時空特異性操作，這對基因功能的研究和人類疾病動物模型的建立具有深刻影響。那你對該系統了解多少呢？小編給大家準備了一系列的干貨知識講解，以供大家參考學習。本期給大家帶來的是Cre-Lox系統的核心原理。

1. 什么是Cre-lox系統？
Cre-lox系統由Cre重組酶和loxp位點兩部分組成。

Cre重組酶
Cre重組酶由噬菌體P1的環化重組酶基因產生的一個38 kDa的DNA重組酶，能特異性地識別Loxp位點，實現DNA片段的重組。除Cre以外，此類重組酶還有Flp（flipase）和Dre（D6特異性重組酶）。

Lox位點
lox位點是一個34bp的序列，由兩個13bp的反向回文重復序列和8bp的中間間隔序列組成：ATAACTTCATGTA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。N表示可變堿基，不同的堿基選擇可形成不同的Lox位點，除了野生型loxP，常見的還有Lox2272，Lox511，Lox5171等，這些突變Lox位點也能被Cre重組酶識別，但只有兩個序列相同的Lox位點之間才能發生重組。
 

圖1 . loxP位點及其突變體位點^[1]

根據lox位點的排列方向和位置，Cre重組酶能介導片段發生刪除、倒轉和易位三種重組事件：

• Deletion（刪除）：當兩個Lox位點在同一染色體上且方向相同時，兩個Lox位點之間的序列將被刪除。

• Inversion（倒轉）：當兩個Lox位點位于同一染色體上且方向相反時，兩個Lox位點之間的序列將發生序列倒轉。

• Translocation（易位）：當兩個Lox位點位于不同的染色體上且方向相同，將導致2條染色體上DNA片段的交換。
   

圖2. Cre的重組機制^[2]。A）loxP位點的基本結構。紅色箭頭指示loxP位點的方向。B）Cre-loxP介導的易位重組。C）左圖示Cre介導兩同向loxP位點間的切除重組。右圖示Cre介導兩反向loxP位點間的反轉重組。

2. 體內Cre-lox系統的基礎應用
利用Cre-lox系統在小鼠體內實現對基因的時空特異性打靶（表達或敲除），原則上需要建立兩種小鼠。

一是Cre工具鼠，該小鼠為攜帶Cre重組酶的基因修飾小鼠。其中，Cre重組酶由特定啟動子驅動，可在特定細胞或組織中表達；二是Flox小鼠，即在靶基因序列兩側插入Lox位點的基因修飾小鼠。通過將上述兩種小鼠交配繁育，即可獲得基因條件性敲除或過表達小鼠。

2.1 基因條件性表達
在基因條件性表達中，Flox小鼠的靶基因與啟動子之間通常插入了一個“終止盒”（lox-stop-lox-GENE）。該元件能阻止靶基因的轉錄和表達。將Flox小鼠與細胞類型特異性表達Cre的工具鼠交配所獲得的子代小鼠中，所有表達Cre重組酶的細胞，stop元件會被刪除。因此，靶基因僅在這些特定細胞中得以表達。

圖3. 條件性基因表達小鼠原理示意圖^[3]

2.2 基因條件性敲除
在基因條件性表達中，Flox小鼠一般在需要刪除的DNA片段兩側帶有同方向的兩個Lox位點（lox-GENE-lox）。將Flox小鼠與細胞類型特異性Cre小鼠交配所獲得的子代小鼠中，所有表達Cre重組酶的細胞，該DNA片段會被刪除。

圖4. 條件性基因敲除小鼠原理示意圖^[3]

3. 更精準的誘導型Cre-lox系統
為更準確地進行遺傳功能研究，時間特異性的Cre-lox（也叫誘導型Cre-lox）被開發出來，可用于研究生物體發育過程特定階段的基因功能，或用來進行譜系示蹤等。常用誘導型Cre-lox系統有：

3.1 CreER系統
通過他莫昔芬（Tam）誘導Cre酶的重組活性。在沒有他莫昔芬的情況下，CreER融合蛋白與熱休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于細胞質中（圖5.1）。給予他莫昔芬藥物處理會破壞HSP90與CreER的相互作用（圖5.2）。ER與Tam的相互作用誘導Cre的核易位（圖5.3）。在細胞核中，CreER識別loxP位點（圖5.4）并使組織X中的基因Y失活（圖5.5）。CreERT2在體內對藥物誘導的敏感性更高，因此一般優選使用CreERT2。
 

圖5. 他莫昔芬（Tam）誘導的Cre系統^[4]

3.2 Cre;Tet系統
四環素誘導系統，也叫強力霉素（Dox，四環素衍生物）誘導的Cre系統。該系統有兩種模式：Tet-on和Tet-off，分別是Dox依賴性Cre的激活和Dox依賴性Cre的失活。Tet系統包括以下元件：反向四環素控制反式激活因子（rtTA）；四環素控制反式激活因子（tTA）；四環素響應元件（TRE），通常是19個核苷酸的四環素操縱子（tetO）序列的7個重復，調節Cre基因的表達。Dox通常在小鼠的飼料或飲水中進行給藥。

Cre;Tet-on系統：Dox給藥才能打開Cre表達。在Tet-on系統中，表達普遍存在的或組織特異性的啟動子驅動的rtTA。在沒有Dox的情況下，失活的rtTA無法與負責調控Cre基因的TRE序列結合，則Cre不表達。在Dox給藥之后，Dox結合并激活rtTA。激活的rtTA與TRE序列結合并誘導Cre表達。
 

圖6. Dox誘導的Cre;Tet-on系統^[4]

Cre;Tet-off系統：Dox給藥后關閉Cre表達。在Tet-off系統中，在沒有Dox的情況下，激活的tTA能夠結合Cre前的TRE序列并誘導Cre表達。而在Dox給藥后，與Dox相互作用的tTA被滅活。滅活的rTA不再與TRE結合，因此Cre表達受到抑制。
 

圖7. Dox誘導的Cre;Tet-off系統^[4]

4. 南模生物Cre/Dre工具鼠庫
南模生物可提供超過600多種自主產權Cre/Dre工具鼠，覆蓋全身各類型的細胞組織，滿足科研人員多樣化的需求。同時，我們還在對Cre/Dre工具鼠進行全面的驗證，目前已經完成了200多種Cre/Dre工具鼠的驗證工作。
 

為方便大家更快的找到自己想要的Cre工具鼠，我們還特別定制了Find Cre搜索系統：https://www.modelorg.com/findcre.html。Find Cre整個界面以小鼠組織、器官和系統為主線，可分為肺、肝、胃腸道、乳腺、胰腺、感覺器官、心血管系統、免疫系統、神經系統、泌尿生殖系統、骨骼肌系統以及其他組織器官。大家選擇自己感興趣的組織器官，就可以查看該組織下可用的Cre工具鼠啦，點擊這里即可快速訪問。

部分Cre品系驗證數據如下：
1 Alb-CreERT2
Alb-CreERT2小鼠是研究肝臟基因功能與疾病的重要小鼠品系，驗證數據證明Alb-CreERT2小鼠可以成為實現肝臟時間特異性敲除或表達的工具鼠。
 

圖8. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝組織X-gal染色。未使用他莫昔芬誘導的小鼠，肝細胞未被染色；使用他莫昔芬誘導的小鼠，肝細胞成功著色。
 

圖9. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝組織免疫熒光檢測。Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠被他莫昔芬誘導后，LacZ（紅色）表達。
 

圖10. Alb-CreERT2小鼠血生化檢測。結果顯示Alb-CreERT2小鼠與野生型小鼠相比肝功能正常。

2 Pvalb-Cre
Pvalb-Cre在中間神經元中表達iCre重組酶，而不干擾內源性Pvalb表達。這些小鼠可能對研究神經元分化有重要作用。

圖11. 熒光檢測Pvalb^Cre+/-; Rosa26^tdTomato+/-小鼠大腦皮層中間神經元tdTomato的表達。

圖12. 熒光檢測Pvalb^Cre+/-; Rosa26^tdTomato+/-小鼠海馬中間神經元tdTomato的表達。結果顯示：雙陽性小鼠海馬中間神經元有tdTomato的表達，表達類型符合預期。

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References

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2. Tronche F, Casanova E, Turiault M, Sahly I, Kellendonk C. When reversegenetics meets physiology: the use of site-specific recombinases in mice. FEBSLett. 2002;529(1):116?\121. doi:10.1016/s0014-5793(02)03266-0
3. Magnuson M , Osipovich A . Pancreas-Specific Cre Driver Lines and Considerations for Their Prudent Use[J]. Cell Metabolism, 2013, 18(1):9-20.
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6. Duffield JS, Humphreys BD. Origin of new cells in the adult kidney:results from genetic labeling techniques. Kidney Int.2011;79(5):494?\501. doi:10.1038/ki.2010.338
7. Feil S, Valtcheva N, Feil R. Inducible Cre mice. Methods MolBiol. 2009;530:343?\363. doi:10.1007/978-1-59745-471-1_18
8. Holzenberger M, Lenzner C, Leneuve P, et al. Cre-mediated germline mosaicism:a method allowing rapid generation of several alleles of a target gene. NucleicAcids Res. 2000;28(21):E92. doi:10.1093/nar/28.21.e92
9. Becher B, Waisman A, Lu LF. ConditionalGene-Targeting in Mice: Problems and Solutions. Immunity. 2018;48(5):835?\836.doi:10.1016/j.immuni.2018.05.002

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