在生物醫(yī)學(xué)研究的微觀世界里，成像技術(shù)無(wú)疑是科學(xué)家們洞察生命奧秘的“眼睛”。從早期的光學(xué)顯微鏡到如今的前沿成像手段，每一次技術(shù)的躍遷都為我們揭開(kāi)了生命活動(dòng)更精細(xì)、更深層的面紗。雙光子顯微鏡（TPM）作為新一代的成像利器，以其獨(dú)特的物理原理和卓越的性能，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域掀起了一場(chǎng)成像革命。雙光子顯微鏡采用近紅外光子作為激發(fā)源，利用兩個(gè)低能光子同時(shí)被吸收來(lái)激發(fā)熒光分子，這一過(guò)程具有空間局域性，能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率的三維成像，同時(shí)減少光漂白和光毒性，為活體組織的長(zhǎng)期觀察提供了可能。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
光學(xué)成像技術(shù)的局限性
光學(xué)成像技術(shù)在生命科學(xué)研究中扮演著舉足輕重的角色。傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡雖能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平的熒光成像，卻受限于紫外-可見(jiàn)光（UV-Vis）單光子激發(fā)方式。這種激發(fā)模式下，光子穿透組織深度有限，易受組織自身熒光干擾，且連續(xù)激光易造成光漂白和光毒性，損害生物樣本。這些局限性嚴(yán)重制約了科學(xué)家們對(duì)生物體內(nèi)深處結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)過(guò)程的觀察。

高效探針研發(fā)的瓶頸
然而，目前雙光子探針的研發(fā)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。理想的探針需具備高選擇性、良好水溶性、細(xì)胞通透性、大雙光子作用截面、高光穩(wěn)定性及低毒性等特性，以滿足多樣化的生物醫(yī)學(xué)需求。探針是雙光子顯微鏡成像的關(guān)鍵，它直接決定了成像的特異性和靈敏度。但兼具這些性能的探針研發(fā)難度極大，這在很大程度上限制了雙光子顯微鏡的廣泛應(yīng)用。現(xiàn)有探針在生物靶點(diǎn)的選擇性、成像深度、信號(hào)強(qiáng)度等方面仍存在不足，難以滿足復(fù)雜生物環(huán)境下的高精度成像需求。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
脂筏成像探針的突破
為攻克探針研發(fā)難題，科研團(tuán)隊(duì)展開(kāi)深入研究。在脂筏成像方面，針對(duì)傳統(tǒng)探針在細(xì)胞中表現(xiàn)不佳的問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)出C-laurdan（CL）。這一改進(jìn)顯著提升了探針?biāo)苄裕蛊湓诓煌愋椭|(zhì)環(huán)境中均能精準(zhǔn)反映脂筏和非脂筏區(qū)域，克服了傳統(tǒng)探針的局限性。CL在細(xì)胞膜中展現(xiàn)出良好的平行排列，其熒光發(fā)射峰在不同脂質(zhì)環(huán)境中的變化與脂筏的物理狀態(tài)高度相關(guān)，為脂筏的可視化提供了可靠工具。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CL標(biāo)記的細(xì)胞在經(jīng)過(guò)處理破壞脂筏后，其GP曲線發(fā)生顯著變化，高GP值部分明顯下降，而低GP值部分保持穩(wěn)定，這一結(jié)果與脂筏破壞引起的細(xì)胞膜物理性質(zhì)改變高度一致，確證了CL對(duì)脂筏的精準(zhǔn)標(biāo)識(shí)能力。

進(jìn)一步地，團(tuán)隊(duì)又研發(fā)了CL2和SL2雙光子開(kāi)啟探針。CL2在脂筏中特異性發(fā)射熒光，成像背景清晰。實(shí)驗(yàn)顯示，CL2標(biāo)記的巨噬細(xì)胞在MβCD處理后熒光信號(hào)消失，而補(bǔ)充膽固醇又可使其恢復(fù)，且與商業(yè)脂筏探針成像結(jié)果高度吻合。SL2則憑借磺酸基團(tuán)的親水性，減少細(xì)胞內(nèi)攝取，更適用于長(zhǎng)期成像。SL2在293T細(xì)胞和新鮮大鼠海馬腦片成像中，展現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞膜脂筏的清晰標(biāo)記，且細(xì)胞內(nèi)攝取極少，為活體組織脂筏研究提供了可靠手段。SL2標(biāo)記的大鼠海馬腦片TPM圖像清晰地展現(xiàn)了CA1和CA3區(qū)域以及齒狀回的脂筏分布，即使在約100μm的深度，仍能分辨出細(xì)胞膜上的亮區(qū)，這些亮區(qū)在MβCD處理后消失，進(jìn)一步驗(yàn)證了SL2對(duì)脂筏的特異性。

兩種探針的雙光子作用截面分別為160GM和175GM，具有較高的亮度和穩(wěn)定性。在RAW264.7細(xì)胞中，這兩種探針?lè)謩e對(duì)線粒體和溶酶體進(jìn)行標(biāo)記，TPM圖像與光學(xué)成像結(jié)果一致，且在生物相關(guān)pH范圍內(nèi)不敏感，可長(zhǎng)期穩(wěn)定成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在饑餓處理2小時(shí)后，溶酶體和線粒體的共定位系數(shù)顯著增加，這與自噬過(guò)程中線粒體被溶酶體降解的生物學(xué)機(jī)制高度吻合。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
脂筏成像實(shí)驗(yàn)
SL2在293T細(xì)胞和新鮮大鼠海馬腦片成像中，展現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞膜脂筏的清晰標(biāo)記，且細(xì)胞內(nèi)攝取極少。SL2標(biāo)記的大鼠海馬腦片TPM圖像清晰地展現(xiàn)了CA1和CA3區(qū)域以及齒狀回的脂筏分布，即使在約100μm的深度，仍能分辨出細(xì)胞膜上的亮區(qū)，這些亮區(qū)在MβCD處理后消失，進(jìn)一步驗(yàn)證了SL2對(duì)脂筏的特異性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新型脂筏探針在細(xì)胞和組織水平上均能實(shí)現(xiàn)對(duì)脂筏的精準(zhǔn)成像，為研究細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能提供了有力工具。

細(xì)胞器成像實(shí)驗(yàn)
對(duì)于細(xì)胞器成像，兩種探針標(biāo)記的HeLa細(xì)胞，其TPM圖像與溶酶體的光學(xué)成像結(jié)果高度重合，而與高爾基體和線粒體無(wú)重疊。兩種探針在RAW264.7細(xì)胞中成像效果與溶酶體和線粒體的光學(xué)成像結(jié)果一致。在自噬實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)自噬后，TPM圖像顯示溶酶體熒光增強(qiáng)、線粒體熒光減弱，且二者融合程度隨時(shí)間增加。這一過(guò)程直觀展現(xiàn)了自噬過(guò)程中線粒體被溶酶體降解的動(dòng)態(tài)過(guò)程。在組織成像中，這兩種探針在120μm深度處仍能清晰分辨溶酶體和線粒體分布，TPM圖像顯示二者在組織中的分布特征與預(yù)期一致，且在不同區(qū)域的分布差異也能被清晰捕捉，為研究細(xì)胞器在組織中的相互作用和功能提供了重要依據(jù)。

總結(jié)與展望
雙光子探針的技術(shù)革新，標(biāo)志著生物醫(yī)學(xué)成像從“結(jié)構(gòu)觀察”邁向“功能解析”的新階段。通過(guò)分子設(shè)計(jì)優(yōu)化，CL、SL2等探針成功克服了傳統(tǒng)工具的靈敏度與特異性瓶頸，而雙色系統(tǒng)則為細(xì)胞器互作研究提供了動(dòng)態(tài)窗口。NP1的臨床驗(yàn)證更是證明，雙光子技術(shù)有望從實(shí)驗(yàn)室走向病床，成為疾病早期診斷的有力工具。隨著探針庫(kù)的擴(kuò)充與成像系統(tǒng)的微型化，雙光子技術(shù)或?qū)⒃谀[瘤免疫治療、神經(jīng)環(huán)路解析及個(gè)性化醫(yī)療中發(fā)揮更核心的作用。