組蛋白修飾對染色質功能具有關鍵調控作用，影響組織分化和癌癥發生等生物過程。游離細胞DNA（（cell-free DNA, cfDNA）是血漿中的非隨機片段化DNA，來源于多種組織的細胞死亡。cfDNA片段化模式，如片段大小、末端基序（end motifs）等，與cfDNA的組織起源密切相關。然而，現有的cfDNA分析方法，如亞硫酸鹽處理或免疫沉淀法，存在DNA丟失和實驗復雜性高的問題。因此，開發一種基于cfDNA片段組學的分析方法，用于推斷組蛋白修飾水平，具有重要的研究和臨床意義。
 
近日，香港中文大學盧煜明教授團隊開發了一種基于cfDNA片段組學（fragmentomics）的分析方法，這種非侵入性評估組蛋白修飾的方法可以推斷cfDNA的組織起源以及相關的病理狀態。這種方法不僅能夠用于健康個體的組織貢獻分析，還能在病理狀態下（如癌癥和血液疾病）檢測相關組織的DNA貢獻。研究通過分析cfDNA的片段大小和末端基序，成功檢測了組蛋白H3K27ac和H3K4me3的修飾水平，并展示了其在非侵入性產前檢測、器官移植監測、血液疾病診斷和癌癥檢測中的潛在應用。相關研究成果以《Histone modifications of circulating nucleosomes are associated with changes in cell-free DNA fragmentation patterns》為題發表于《美國國家科學院院刊》（PNAS）。



標題：Histone modifications of circulating nucleosomes are associated with changes in cell-free DNA fragmentation patterns（循環核小體的組蛋白修飾與cfDNA片段化模式的變化相關）
發表時間：2024-10-9
發表雜志：PNAS
影響因子：9.4/1區
技術平臺：cfChIP-seq
 
本研究團隊開發了一種通過鑒定與候選組蛋白修飾相關的特異性片段化模式來分析不同組織DNA對血漿相對貢獻的方法，并將其命名為基于片段組學的組蛋白修飾分析（FRAGHA）。推斷出胎盤特異性組蛋白H3K27ac信號與孕婦血漿中的胎兒DNA比例高度相關。推斷出肝臟特異性H3K27ac信號與肝移植受者的供體來源DNA比例相關，并且在肝細胞癌（HCC）患者中顯著增加。在β-地中海貧血和結直腸癌患者中，分別觀察到紅細胞特異性和結腸特異性H3K27ac信號顯著升高。此外利用組織特異性H3K27ac區域的片段化模式，研究團隊開發了一種機器學習算法以增強HCC檢測能力，其曲線下面積（AUC）達0.97。研究團隊分析結果揭示發現H3K27ac或組蛋白H3K4me3的基因組區域表現出不同cfDNA片段化模式。本研究闡明了cfDNA片段組學與組蛋白修飾之間的關系，從而擴展了液體活檢技術手段。

總之，本研究結果表明組蛋白修飾與血漿中cfDNA的片段化模式變化密切相關。這種相關性為通過非侵入性cfDNA分析推斷與生理或病理過程相關的組蛋白修飾提供了基礎。從生理學角度看，這種方法可以通過分析孕婦的血漿來非侵入性評估胎盤中的組蛋白修飾。從病理學角度看，這種方法能夠實現癌癥和血液疾病的非侵入性檢測。本研究加深了對cfDNA片段組學生物學的理解，并擴展了液體活檢的診斷手段。
 
研究方法
1. 樣本收集與處理：招募健康受試者、孕婦、肝移植受者、肝細胞癌（HCC）患者、β-地中海貧血患者和結直腸癌（CRC）患者，從受試者血液中分離血漿，并提取cfDNA。
2. cfChIP-seq：對特定組蛋白修飾（如H3K27ac和H3K4me3）的cfDNA 進行cfChIP-seq（cell-free chromatin immunopreciPItation sequencing）高通量測序，分析其在基因組中的分布，特別是與轉錄起始位點（TSS）和增強子區域的關聯。
3. cfDNA片段組學分析：片段大小分析和末端基序分析。
4. 線性回歸模型構建：基于cfDNA片段大小和末端基序頻率，構建線性回歸模型，用于推斷血漿中組蛋白修飾（H3K27ac和H3K4me3）的水平。
5. 組織特異性分析：通過分析不同組織（如胎盤、肝臟、紅細胞、結腸等）特異性的組蛋白修飾區域，推斷cfDNA組織起源。
6. 機器學習算法開發：結合片段大小和末端基序信息，開發支持向量機（support vector machine，SVM）模型，用于癌癥（如HCC）的檢測。
7. 臨床應用驗證：在不同臨床場景（如β-地中海貧血、HCC、CRC等）中，分析推斷的組蛋白修飾信號變化。
 
圖1：FRAGHA分析示意圖
結果圖形
（1）H3K27ac水平與cfDNA片段大小之間的相關性，并推斷H3K27ac水平
研究團隊利用cfChIP-seq測序分析結果揭示，隨著H3K27ac信號水平的增加，cfDNA片段在50-150bp、230-350bp和420-500bp范圍內頻率逐漸增加，而在160-225bp和360-400bp范圍內頻率則呈現相反模式。這些片段大小與H3K27ac信號高度相關，表明cfDNA片段大小模式可以作為H3K27ac水平的推斷指標。

同時，研究人員構建了一個線性回歸模型，基于片段大小推斷血漿中的H3K27ac水平。在五個健康對照樣本中，通過比較片段大小推斷的H3K27ac信號與cfChIP-seq檢測的實際H3K27ac信號，發現兩者具有良好的一致性。尤其是230-350bp范圍內的片段頻率能夠最準確地預測實際的H3K27ac信號。
  圖2：cfDNA片段大小模式與通過匹配樣本的cfChIP-seq測序檢測的循環核小體H3K27ac信號之間的相關性。
(A) 不同H3K27ac信號水平的區域類別（n=549）的cfDNA分子片段大小分布圖。
(B-F) 在這549個不同H3K27ac信號水平的區域類別中，特定大小范圍內的cfDNA分子比例與通過cfChIP-seq測序確定的H3K27ac信號相關性。這些大小范圍包括50-150bp（B）、160-225bp（C）、230-350bp（D）、360-400bp（E）和420-500bp（F）。
(G-K) 對于另外五名健康對照受試者，通過片段大小和cfChIP-seq測序推斷的18種組織特異性區域中的H3K27ac信號的相關性。
 
（2）H3K27ac相關信號的組織起源分析
研究者利用妊娠模型分析了胎盤特異性H3K27ac修飾區域的推斷信號與胎兒DNA比例之間的關系。結果顯示胎盤特異性H3K27ac信號與胎兒DNA比例高度相關。同樣在肝移植受者中，肝臟特異性H3K27ac信號與供體來源的DNA比例也高度相關。表明推斷的H3K27ac信號可以用于追溯cfDNA的組織起源。
  圖3：組織特異性H3K27ac相關信號可以反映妊娠和肝移植模型的血漿中組織DNA貢獻。
  (A) 30名孕婦的胎盤特異性H3K27ac相關信號與胎兒DNA比例的相關性。
(B) 14名肝移植受者的肝臟特異性H3K27ac相關信號與供體來源DNA比例的相關性。
  圖4：利用組織特異性組蛋白修飾區域的片段大小推斷H3K27ac相關信號分布。測序后的cfDNA分子來自38名健康對照個體。H3K27ac相關信號通過230-350bp范圍內的分子大小頻率推斷。
 
（3）血漿中推斷H3K27ac相關信號的臨床應用
研究人員進一步探討了推斷的H3K27ac信號在臨床應用中的潛力。在β-地中海貧血患者中，紅細胞特異性H3K27ac信號顯著高于健康對照組。在肝細胞癌（HCC）患者中，肝臟特異性H3K27ac信號也顯著升高。在結直腸癌（CRC）患者中，結腸特異性H3K27ac信號也顯著升高。這些結果表明，推斷的H3K27ac信號可以用于檢測血液疾病和癌癥。
  圖5：通過cfDNA片段化模式推斷H3K27ac相關信號的臨床應用。
  (A) 健康受試者（n=63）和β-地中海貧血患者（n=10）的紅細胞特異性區域中的H3K27ac相關信號。
(B) 健康受試者（n=63）、HBV攜帶者（n=17）和肝細胞癌（HCC）患者（n=34）的肝臟特異性區域中的推斷H3K27ac相關信號。
(C-D) 健康受試者（n=8）、有（n=4）和無（n=7）肝臟轉移的結直腸癌（CRC）患者的結腸特異性區域和肝臟特異性區域中的推斷H3K27ac相關信號。
 
（4）cfDNA末端基序分析對H3K27ac相關信號的推斷，并通過組織特異性H3K27ac修飾相關的片段大小和末端基序聯合分析用于癌癥檢測。
研究者還分析了cfDNA片段末端基序與H3K27ac信號之間的關系。分析結果表明特定的4-mer末端基序（如CCGG、CCGC等）在H3K27ac信號高的區域中頻率顯著高于信號低的區域。基于這些末端基序，研究者構建一個線性回歸模型用于推斷H3K27ac信號。結果顯示，胎盤特異性H3K27ac信號與胎兒DNA比例和肝臟特異性H3K27ac信號與供體來源的DNA比例均具有顯著相關性。
此外，研究者開發了一個整合了片段大小和末端基序數據的支持向量機（SVM）模型用于癌癥檢測。在包含34名HCC患者、17名HBV攜帶者和63名健康對照的隊列中，該模型能夠高效區分HCC患者和非HCC患者，AUC達0.97。在另一個獨立隊列中，AUC也達到0.93。這表明整合片段大小和末端基序的聯合分析方法在癌癥檢測中具有較高準確性。
  圖6：通過cfDNA末端基序分析推斷的H3K27ac相關信號分析。
  (A) 30名妊娠者的胎盤特異性區域中，通過七種信息性末端基序的頻率推斷的H3K27ac相關信號。
(B) 14名肝移植受者的肝臟特異性區域中，通過七種信息性末端基序的頻率推斷的H3K27ac相關信號。
(C) 數據集I中，通過結合片段大小和末端基序分析組織特異性H3K27ac修飾區域的HCC概率比較。
(D) 數據集I中，利用與H3K27ac相關的不同片段組學特征區分有無HCC患者的ROC分析。
(E) 數據集II中，通過結合片段大小和末端基序分析組織特異性H3K27ac修飾區域的HCC概率比較。
(F) 數據集II中，利用與H3K27ac相關的不同片段組學特征區分有無HCC患者的ROC分析。
 
（5）通過 cfChIP-seq分析cfDNA 片段模式的H3K4me3修飾
研究者還分析了H3K4me3修飾與cfDNA片段大小之間的關系。結果顯示，230-350bp范圍內的片段頻率與H3K4me3信號高度相關。在HCC患者中，肝臟特異性H3K4me3信號顯著升高。此外，研究還發現H3K27ac和H3K4me3修飾的cfDNA片段化模式存在差異，這為通過片段組學分析區分不同組蛋白修飾提供了可能。
  圖7：通過cfDNA片段化模式分析H3K4me3修飾。
  (A) cfDNA分子在230-350bp范圍內的比例與通過cfChIP-seq測序確定的H3K4me3信號相關性。測序的cfDNA分子來自之前發表研究中38名健康受試者的整合測序結果。
(B) 健康受試者（n=63）、HBV攜帶者（n=17）和肝細胞癌（HCC）患者（n=34）的肝臟特異性區域中的推斷H3K4me3相關信號。
(C) 基于38名健康受試者的cfDNA分子整合測序，繪制的cfDNA片段大小分布熱圖，涵蓋富集H3K27ac或H3K4me3或共修飾的區域。
(D) 基基于38名健康受試者的cfDNA分子整合測序，繪制的cfDNA片段末端基序模式熱圖，涵蓋富集H3K27ac或H3K4me3或共修飾的區域。
 
易小結
本研究通過分析cfDNA的片段大小和末端基序，成功推斷了組蛋白H3K27ac和H3K4me3的修飾水平，并展示其在非侵入性產前檢測、器官移植監測、血液疾病診斷和癌癥檢測中的潛在應用。這種方法為液體活檢技術的發展提供了新的工具，有望在未來的臨床實踐中發揮重要作用。

研究也存在一些局限性
首先，不同組織中可能同時存在多種組蛋白修飾，這可能會影響推斷信號的準確性。
其次，不同的DNA文庫制備方法可能引入預分析偏差，影響結果的可比性。
此外，研究的樣本量相對較小，需要在更大的樣本隊列中進行驗證。
最后，雖然研究展示了片段組學分析的潛力，但其在臨床應用中的實際效果仍需進一步評估。

cfChIP-seq分析在本研究中的重要作用
cfChIP-seq是本研究的關鍵技術之一。它通過捕獲血漿中帶有特定組蛋白修飾的cfDNA分子，提供了cfDNA片段化模式與組蛋白修飾水平之間的直接聯系。cfChIP-seq數據不僅用于驗證基于片段組學推斷組蛋白修飾信號的準確性，還為研究cfDNA的組織起源和病理狀態提供了重要參考。通過cfChIP-seq，研究者能夠確定不同組織特異性區域的組蛋白修飾水平，從而為非侵入性診斷方法的開發奠定基礎。