豬流行性腹瀉病毒熒光PCR檢測試劑盒 （實時熒光PCR法）
使用說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：豬流行性腹瀉病毒熒光PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Porcine ePIdemic diarrhea virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測豬流行性腹瀉病毒，對豬流行性腹瀉病毒引起的疾病診斷及療效評估有重要指導意義。

【原     理】
本試劑盒針對豬流行性腹瀉病毒的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含豬流行性腹瀉病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量pcr儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性分析。

【 試劑盒 組成】

序號	組成	50T/盒
1	PEDV RT-PCR反應液	875 μL×1管
2	PEDV 混合酶液	125 μL×1管
3	PEDV陽性對照	40 μL×1管
4	PEDV陰性對照	40 μL×1管
5	說明書	1份

注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含豬流行性腹瀉病毒靶基因的質粒。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】
1. 適用標本類型：發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結等)和病毒培養(yǎng)液。
2. 標本采集，方法如下：
(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉至5ml 的干燥管中，密閉送檢。
(2) 腸內容物：無菌條件下取腸道內容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中，立即送檢。
(3) 組織臟器：取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中，密閉送檢。
3.應避免標本間交叉污染。
4.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。

【檢驗方法】
1.  試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)	RT-PCR反應液	17.5 μL
	混合酶液	2.5 μL

  （3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增。

反應體積	25 μL	通道選擇	FAM通道采集豬流行性腹瀉病毒熒光信號
PCR 反應 條件	步驟	條件	循環(huán)數(shù)
	反轉錄	50℃：10分鐘（min）	1
	預變性	95℃：3分鐘（min）	1
	PCR擴增	95℃：5秒（s）	40
		55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號）

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】

通道及檢測結果	標本檢測結果解釋
FAM
+	標本中檢出豬流行性腹瀉病毒
-	標本中未檢出豬流行性腹瀉病毒

  【檢驗方法的局限性】

• 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結果。
• 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結果。
• 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最低檢出限為10 ³Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。

【注意事項】

• 使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關部分頒布的有關基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
• 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理；
• 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結束后，應立即對工作臺清潔；
• 吸取反應液時，應盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結果不準確；
• 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心；
• 試劑盒內所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū)，并單獨存放；
• 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記；
• 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內，檢測結束的PCR 反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；
• 儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內使用。