核酸藥物歷經幾十年的發展，始終受限于遞送系統這一關鍵技術瓶頸。脂質納米顆粒（liPId nanoparticle, LNP）技術的研發極大地推動了核酸藥物的發展。新冠疫情期間 mRNA 疫苗的大放異彩更是將核酸藥物的研發和產業化推向了前所未有的高度。盡管 mRNA-LNP 的制備工藝步驟簡單、周期較短，但短短幾分鐘內就可能存在復雜的相變。近年來，國內外監管機構相繼發布了 mRNA 疫苗的技術指南，如國家藥品監督管理局藥品審評中心于 2020 年 8 月發布《新型冠狀病毒預防用 mRNA 疫苗藥學研究技術指導原則（試行）》，世界衛生組織（World Health Organization, WHO）2021 年 12 月發布的“Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations”，美國藥典（USP）于 2022 年 2 月發布了題為“mRNA 疫苗質量分析方法”的指南草案等，初步建立了 mRNA 疫苗的質量評價標準。

1999 年 3 月，國際人用藥品注冊技術要求協會（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH）為了協調歐盟、美國、日本等主要市場的監管標準，減少研發和審批壁壘，制定了《質量標準：生物技術產品及生物制品的檢測方法和驗收標準》，作為生物技術藥物的指導原則，簡稱 ICH Q6B。ICH Q6B 對于生物制品強調了生產工藝全過程控制，同時認為，在質量標準中納入哪些質控項目需要根據產品工藝特點、特性特點及其與安全有效性、質量可控性的相關性予以確定。國家藥品監督管理局藥品審評中心研究團隊根據 ICH Q6B 理念，發表了《預防用 mRNA 疫苗脂質納米顆粒質量研究及質量控制藥學評價的考慮》，從藥學評價角度對上述結構特點、變化趨勢等進行初步探討，對結構特征需要額外開展的研究工作提出建議，希望為預防用 mRNA 疫苗研發、生產及產品質量提升提供借鑒。

研究建議
一、粒徑分布和顆粒濃度
粒徑大小是決定納米藥物的半衰期和在體內分布的關鍵參數，粒徑較小的納米藥物更可能會逃脫吞噬細胞的攝取。藥用脂質體的顆粒尺寸一般不大于 100  nm，尤其是在腸胃外給藥的情況下。此外，顆粒濃度作為納米藥物分析中另一個非常重要的參數，直接影響產品的給藥劑量和治療效果。

本文研究建議：采用多種檢測方法對關鍵指標進行研究，例如：粒徑檢測，除常規的 DLS 法，建議采用 NTA、電鏡計數、凝膠色譜、納米流式等方法以及總粒子計數等方法。

NanoFCM 可在單顆粒水平實現納米藥物的粒徑分布和顆粒濃度的無標記分析，通過靈活的圈門策略能夠定向圈出特定粒徑范圍內顆粒的分布和占比情況。如圖 1 所示，LNPs 樣本的粒徑分布為 40-150 nm，平均值 84.1 nm；通過單顆粒計數方法標定該樣本中顆粒濃度為 2.67E+12 particles/mL。

圖1. mRNA LNPs 的粒徑和濃度分析

圖2. mRNA LNPs 的濃度梯度稀釋曲線

二、mRNA 空載體數
在 mRNA-LNP 的制備過程中，部分脂質可能未能成功包封 mRNA，形成空載體。這些空載體的存在會影響 mRNA 的封裝率和遞送效率。

本文研究建議：開展制劑過程中不同階段（如包封、pH 調整及超濾等過程中）產物不含 mRNA 的空載體數、顆粒數及顆粒濃度、脂質成分均勻性等研究。

NanoFCM 可以通過熒光標記等手段，區分包封了 mRNA 的顆粒和空載體。mRNA LNPs 顆粒通過探測區時，同時產生側向散射 SS 和熒光 FL 信號，有 SS 信號無對應的 FL 信號的顆粒為空的 LNP，在二維散點圖中，mRNA LNPs 和空載 LNPs 清晰地分成兩個群體（圖3）?；诩{米流式檢測技術僅需 1 min 即可實現 mRNA-LNPs 樣本中空載率的準確定量，且經過梯度稀釋驗證線性良好，證明結果的準確性（圖4）。此外，mRNA LNPs 空載率檢測已被納入石藥集團的創新技術。（詳見往期文章：《重磅|石藥集團發布 mRNA-LNPs 的創新制備方法》）

圖3. NanoFCM 對 mRNA-LNPs 的空載率表征

圖4. mRNA LNPs 的裝載率實測與理論線性關系

三、mRNA 在 LNP 分布位置
本文研究建議：可開展制劑過程中不同階段（如包封、pH 調整及超濾等過程中）產物 mRNA 在 LNP 中分布位置的拓展性、探索性研究。

通常大家認為 mRNA 要么被包封在 LNP 里面，要么游離在溶液中，有沒有第三種形態存在呢？NanoFCM憑借卓越的單分子熒光檢測技術給出了顛覆性答案——mRNA 竟會“黏”在 LNP 表面！通過創新的核酸染料標記策略，首次揭示了 mRNA-LNP 體系的五種存在形態：游離 mRNA、空殼 LNP、包封 LNP 以及表面吸附 mRNA 的 LNP。NanoFCM 基于跨膜及非跨膜核酸染料對 mRNA 疫苗進行標記，并結合 RNase 處理策略以實現疫苗樣本中 mRNA 分子的精準定位分析。圖5詳細概括了通過不同的標記策略來進行核酸定位分析，相關人員可以采用同樣的標記策略對 mRNA LNPs 進行核酸定位分析，進而優化制劑配方和下游工藝流程，盡可能最大化地實現 mRNA 的有效裝載，獲得高純度、高裝載效率的 mRNA LNPs 產品。
 

圖5. 核酸定位分析

四、包封率檢測
本文研究建議：包封率檢測，除常規使用的 RiboGreen 法，建議采用不同或互補的檢測方法，如超速離心、超濾、凝膠色譜等進一步確證，在確證研究中采用不同條件包括極端條件處理后的產品以驗證相關檢測方法的適用性和產品的降解途徑等。

NanoFCM 在單次上樣中同時獲得游離 mRNA 與 LNP 包封 mRNA 的熒光信號。基于熒光強度與核酸分子的拷貝數成線性正相關關系，直接定量分析每個納米顆粒內 mRNA 拷貝數。根據藥典中關于包封率的定義，NanoFCM 可以快速計算包封率。NanoFCM 專業版的軟件能夠一鍵生成核酸拷貝數和包封率的結果，以極致的時間與樣本利用率，重新定義納米樣品檢測的生產力標準（圖6）。
 

圖6. NanoFCM 對 mRNA-LNPs 的核酸拷貝數和包封率表征

展望
本文對 mRNA-LNP 質量研究的建議為疫苗的研發和生產提供了明確的方向。NanoFCM 憑借其獨特的優勢，可在單顆粒水平實現核酸藥物粒徑分布、顆粒濃度、空殼率、藥物包封率及核酸定位等參數的定量分析。通過 NanoFCM 的應用，研究人員可以更全面地了解 mRNA-LNP 的質量屬性，優化生產工藝，提高疫苗的安全性和有效性，為 mRNA 疫苗的研發和臨床應用提供有力保障。