眼-腦軸新突破：眼部3D成像應(yīng)用于阿爾茨海默病Aβ檢測_abio生物試劑品牌網(wǎng)
近年來，隨著對AD病理機(jī)制的深入研究，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)眼睛作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的延伸，可能成為檢測腦部AD病理變化的無創(chuàng)窗口。光片熒光顯微鏡（LSFM）結(jié)合組織透明化技術(shù)的出現(xiàn)，為研究眼與腦中β-淀粉樣蛋白（Aβ）的三維分布提供了有力工具。
研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
AD早期診斷的困境與眼部檢測的潛力
隨著對AD病理機(jī)制的深入研究，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)眼組織與腦組織在胚胎起源及結(jié)構(gòu)功能上有密切聯(lián)系，這使得眼睛有望成為檢測腦部AD病理變化的無創(chuàng)窗口。眼部的視網(wǎng)膜、視神經(jīng)等結(jié)構(gòu)不僅在解剖上與大腦相連，而且在生理和病理過程中也具有相似性。然而，盡管眼部檢測具有無創(chuàng)、便捷、成本低等優(yōu)勢，但如何準(zhǔn)確量化眼部Aβ并建立其與腦部Aβ負(fù)擔(dān)的相關(guān)性仍是一個(gè)亟待解決的問題。
二維成像技術(shù)在評估完整眼球中Aβ的三維空間分布方面存在明顯局限。二維切片方法破壞了眼球的三維結(jié)構(gòu)完整性，難以全面捕捉Aβ在整個(gè)眼球中的分布特征。此外，二維圖像的分析往往依賴于對有限切片的觀察和測量，容易導(dǎo)致數(shù)據(jù)的片面性和不準(zhǔn)確性。
組織透明化與三維成像的技術(shù)難題
光片熒光顯微鏡（LSFM）結(jié)合組織透明化技術(shù)為解決上述問題提供了新的可能性，但在實(shí)際應(yīng)用中也面臨諸多技術(shù)難題。首先，如何優(yōu)化透明化方案，確保眼球各部分組織的均勻透明化，同時(shí)避免組織結(jié)構(gòu)的破壞和抗原性的喪失，是該技術(shù)面臨的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。其次，三維成像需要高分辨率的顯微鏡系統(tǒng)和精確的圖像重建算法。在對完整眼球和大腦進(jìn)行成像時(shí)，如何在大樣本范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)均勻的熒光激發(fā)和信號(hào)檢測，以及如何處理和分析海量的三維圖像數(shù)據(jù)，也是需要克服的技術(shù)障礙。此外，為了實(shí)現(xiàn)對Aβ的特異性標(biāo)記，還需要選擇合適的熒光探針或染色劑，并優(yōu)化染色條件，以減少背景信號(hào)和非特異性結(jié)合，提高成像的靈敏度和特異性。
技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
光片熒光顯微鏡結(jié)合組織透明化技術(shù)的原理與優(yōu)勢
光片熒光顯微鏡（LSFM）結(jié)合組織透明化技術(shù)是本研究的核心創(chuàng)新點(diǎn)之一。組織透明化技術(shù)通過化學(xué)方法去除樣本中的脂質(zhì)和部分蛋白質(zhì)，使原本不透明的生物組織變得透明，從而允許光線深入穿透樣本，為三維成像提供了基礎(chǔ)。LSFM則利用薄薄的光片對樣本進(jìn)行逐層激發(fā)，僅照亮焦平面處的熒光分子，減少了非焦平面的熒光干擾，提高了成像的信噪比和分辨率。與傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡相比，LSFM具有成像速度快、光漂白和光毒性低等優(yōu)勢，特別適合對大體積樣本進(jìn)行高分辨率三維成像。結(jié)合組織透明化技術(shù)，LSFM可以實(shí)現(xiàn)對完整眼球和大腦組織中Aβ的深度可視化，揭示其在三維空間中的分布特征和相互作用關(guān)系，為研究阿爾茨海默病的病理機(jī)制提供了前所未有的視角。
多重標(biāo)記與成像方案的設(shè)計(jì)
為了全面評估阿爾茨海默病小鼠眼與腦中的Aβ負(fù)擔(dān)以及相關(guān)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種多重標(biāo)記與成像方案。具體來說，使用硫黃素S對Aβ進(jìn)行特異性染色，這是一種常用的Aβ染色劑，能夠與Aβ斑塊中的β-疊結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，發(fā)出熒光信號(hào)。同時(shí)，采用抗CD11b抗體標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞和抗ACSA-2抗體標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，以觀察神經(jīng)炎癥細(xì)胞在Aβ沉積周圍的反應(yīng)情況。這種多重標(biāo)記方案使得研究人員能夠在同一張三維圖像中同時(shí)觀察到Aβ斑塊、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分布和相互關(guān)系，為深入理解阿爾茨海默病的病理生理過程提供了豐富的信息。在成像參數(shù)設(shè)置方面，研究人員根據(jù)不同的熒光標(biāo)記物選擇了相應(yīng)的激發(fā)波長（488nm、561nm和647nm），并優(yōu)化了顯微鏡的光片厚度、步長和曝光時(shí)間等參數(shù)，以確保獲得高質(zhì)量的三維圖像。
在數(shù)據(jù)分析方面，研究團(tuán)隊(duì)采用了Imaris軟件生成感興趣區(qū)域的三維表面模型，并結(jié)合自動(dòng)閾值算法實(shí)現(xiàn)了對Aβ顆粒的準(zhǔn)確分割和量化。自動(dòng)閾值算法通過分析圖像的灰度直方圖，自動(dòng)確定最佳閾值以區(qū)分目標(biāo)信號(hào)和背景噪聲，減少了人為因素對結(jié)果的影響。同時(shí)，為了進(jìn)一步提高分割的準(zhǔn)確性，研究人員還進(jìn)行了手動(dòng)修正，去除非細(xì)胞顆粒的誤識(shí)別，如纖維狀塵埃等。通過這種半自動(dòng)化的分析流程，研究人員能夠精確測量每個(gè)Aβ顆粒的體積、表面積等參數(shù)，并對整個(gè)眼球和大腦中的Aβ負(fù)擔(dān)進(jìn)行量化分析。此外，研究團(tuán)隊(duì)還開發(fā)了一種基于體積渲染的可視化方法，將復(fù)雜的三維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為直觀的圖像，便于觀察和比較不同樣本之間的差異。這種方法不僅提高了數(shù)據(jù)分析的效率和準(zhǔn)確性，還為研究結(jié)果的展示和解釋提供了有力支持。
成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
AD小鼠與對照組樣本的收集與處理
研究人員選取了10只44周齡的5xFAD轉(zhuǎn)基因AD小鼠和7只同齡的C57BL/6J野生型小鼠作為對照組。5xFAD小鼠是一種常用的阿爾茨海默病動(dòng)物模型，其基因組中攜帶了五種家族性AD突變，能夠模擬人類AD患者大腦中Aβ的過度產(chǎn)生和沉積。在實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠先接受經(jīng)顱灌注，隨后取出眼球和大腦組織，并將其固定在4%碘酸鹽溶液中。為了進(jìn)行組織透明化處理，研究團(tuán)隊(duì)使用了親水性Binaree組織透明化試劑盒，按照特定的步驟和條件對樣本進(jìn)行處理，包括初始透明化、洗滌和通透化等過程。盡管在透明化過程中有4個(gè)AD小鼠眼球因機(jī)械應(yīng)力等因素受損，但最終成功處理了6個(gè)AD小鼠眼球、7個(gè)對照組眼球、10個(gè)AD大腦和7個(gè)對照組大腦樣本，為后續(xù)的成像和分析提供了足夠的樣本 量 。
眼球和大腦中Aβ的三維分布特征
通過LSFM成像技術(shù)，研究人員觀察到AD小鼠的眼球和大腦中均存在大量的Aβ斑塊樣特征，且其分布具有一定的規(guī)律性。在眼球中，Aβ的積累不僅局限于視網(wǎng)膜和視神經(jīng)等后部結(jié)構(gòu)，還在虹膜、角膜和晶狀體等前部區(qū)域有顯著分布。這表明Aβ在眼球中的沉積具有廣泛的三維分布特征，可能影響眼部的多個(gè)功能區(qū)域。與對照組相比，AD小鼠眼球中的Aβ總斑塊數(shù)量、總表面積和總表面體積均顯著增加。在大腦中，AD小鼠同樣表現(xiàn)出更高的攝取和更大的Aβ斑塊樣特征的總表面積和總表面體積。這些結(jié)果充分證明了AD小鼠眼與腦中Aβ負(fù)擔(dān)的顯著增加，為深入研究其相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。
眼與腦Aβ負(fù)擔(dān)的相關(guān)性分析
研究的一個(gè)關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是眼球和大腦中 Aβ斑塊樣特征的總表面積和總表面體積之間存在強(qiáng)正相關(guān)。相關(guān)系數(shù)分析顯示，眼球和大腦中Aβ總表面積的相關(guān)系數(shù)為0.722，總表面體積的相關(guān)系數(shù)為0.810，P值均小于0.01。這表明眼球中Aβ的三維分布與大腦中的Aβ負(fù)擔(dān)具有高度的相關(guān)性，即眼球中Aβ的積累程度可以反映大腦中Aβ的病理狀態(tài)。此外，單個(gè)斑塊樣特征的表面積和體積在眼球和大腦之間也表現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.808和0.824，P值均小于0.01。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了眼與腦Aβ負(fù)擔(dān)之間存在密切聯(lián)系的觀點(diǎn)，為開發(fā)基于眼部檢測的AD早期診斷工具提供了科學(xué)依據(jù)。然而，值得注意的是，研究中并未發(fā)現(xiàn)眼與腦之間Aβ斑塊樣特征的形態(tài)參數(shù)（如橢球度和球形度）存在顯著相關(guān)性，這可能表明Aβ在眼和腦中的聚集形態(tài)存在差異，其背后的生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。
神經(jīng)炎癥反應(yīng)的差異性觀察
在對神經(jīng)炎癥反應(yīng)的觀察中，研究人員發(fā)現(xiàn)AD小鼠大腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)顯著增加，這與已知的AD病理特征一致，表明大腦中存在明顯的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。然而，在AD小鼠的眼球中并未檢測到這些神經(jīng)炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。這一結(jié)果可能有多種解釋。一方面，可能是因?yàn)楸狙芯恐惺褂玫?4周齡AD小鼠處于疾病的早期階段，眼部的神經(jīng)炎癥反應(yīng)尚未充分發(fā)展，或者其表達(dá)水平較低而無法被當(dāng)前的檢測方法所捕捉。另一方面，也可能與實(shí)驗(yàn)中使用的抗體穿透能力有限有關(guān)，導(dǎo)致未能有效標(biāo)記眼部的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。此外，眼部的免疫環(huán)境與大腦有所不同，可能對神經(jīng)炎癥反應(yīng)的激活和表現(xiàn)形式產(chǎn)生影響。這一發(fā)現(xiàn)提示我們在研究阿爾茨海默病的神經(jīng)炎癥機(jī)制時(shí)，需要充分考慮眼與腦之間的差異性，進(jìn)一步探索眼部神經(jīng)炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)及其與腦部神經(jīng)炎癥的關(guān)系。
總結(jié)與展望
研究利用光片熒光顯微鏡結(jié)合組織透明化技術(shù)，首次實(shí)現(xiàn)了對完整眼球和大腦中Aβ負(fù)擔(dān)的三維可視化和量化分析，并發(fā)現(xiàn)了眼與腦中Aβ負(fù)擔(dān)的強(qiáng)相關(guān)性。這一發(fā)現(xiàn)不僅加深了我們對Aβ病理系統(tǒng)性本質(zhì)的理解，而且為開發(fā)基于眼部Aβ檢測的無創(chuàng)早期診斷工具提供了科學(xué)依據(jù)。然而，研究也存在局限性，如樣本量較小、僅針對特定年齡段的小鼠模型等。未來的研究應(yīng)擴(kuò)大樣本量，涵蓋不同疾病階段和遺傳背景的模型，并進(jìn)一步探索眼與腦Aβ相關(guān)性的分子機(jī)制和生物學(xué)意義。此外，還需要開發(fā)更特異的成像探針和更先進(jìn)的成像技術(shù)，以提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。盡管如此，本研究的成果仍為阿爾茨海默病的早期診斷和治療監(jiān)測提供了新的視角和潛在的生物標(biāo)志物，有望推動(dòng)該領(lǐng)域向更精準(zhǔn)、更無創(chuàng)的診斷方法發(fā)展。
論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Son HJ, Kim S, Kim SY, Jung JH, Lee SH, Kim SJ, Kim C, Hahn A. Three-Dimensional β-Amyloid Burden Correlation Between the Eye and BrAIn in Alzheimer's Disease Mice Using Light-Sheet Fluorescence Microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025 Mar 3;66(3):34.
DOI:10.1167/iovs.66.3.34.
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