缺血性中風(fēng)是全球致殘和致死的主要病因之一，即便大血管成功再通，仍有部分患者因“無復(fù)流”現(xiàn)象（大血管再通但組織未恢復(fù)灌注）預(yù)后不佳?！盁o復(fù)流”的核心機制——微血管阻塞，長期以來因缺乏能同時觀察大腦皮層和皮層下區(qū)域的三維成像技術(shù)而難以破解。

華中科技大學(xué)朱丹團隊在《Theranostics》（2023年第13卷第1期）發(fā)表研究，開發(fā)了一種基于雙熒光標(biāo)記和組織透明化的三維微血管成像技術(shù)。通過在小鼠缺血再灌注模型中注射兩種不同顏色的番茄凝集素（分別標(biāo)記所有血管和功能性血管），結(jié)合iDISCO+組織透明化技術(shù)和光學(xué)成像，首次實現(xiàn)了缺血后微血管阻塞的三維可視化。研究發(fā)現(xiàn)，微血管阻塞隨時間逐漸加重，同時涉及小動脈和毛細血管，其中毛細血管阻塞與管腔狹窄及中性粒細胞滯留密切相關(guān)，且中性粒細胞主要通過加劇管腔狹窄而非直接栓塞導(dǎo)致阻塞。

重要發(fā)現(xiàn)
01雙熒光標(biāo)記策略：精準(zhǔn)定位阻塞血管
傳統(tǒng)方法難以區(qū)分“存在但不流通”的血管與“正常流通”的血管。朱丹團隊設(shè)計了一種“時間差”標(biāo)記法：

紅色凝集素：在缺血前注射，標(biāo)記所有存活的血管（無論后續(xù)是否通暢）；

綠色凝集素：在再灌注后注射，僅標(biāo)記仍有血流通過的功能性血管。

原理：若某段血管僅顯紅色，說明其在缺血后阻塞，無法讓綠色凝集素流過——這便是“微血管阻塞”的直接證據(jù)。通過這種方法，研究團隊在小鼠大腦中清晰識別出僅含紅色信號的阻塞血管，主要分布在紋狀體（比皮層更嚴(yán)重），證實了缺血核心區(qū)的微血管損傷差異。

02 iDISCO+組織透明化：從“混沌腦塊”到“透明標(biāo)本”
大腦組織本身不透明，傳統(tǒng)切片成像僅能獲取二維信息，且易遺漏深層結(jié)構(gòu)。研究團隊對比了多種透明化技術(shù)（如CUBIC、PACT、uDISCO等），最終選擇iDISCO+，因其能最大程度保留熒光信號、維持組織形態(tài)，且透明速度快。

流程：固定后的腦組織經(jīng)甲醇脫水、過氧化氫漂白、二氯甲烷脫脂，最終浸泡在二芐醚（是一種用于組織光學(xué)透明化處理的溶劑）中，變得近乎透明。

效果：結(jié)合共聚焦顯微鏡或光片顯微鏡，可對1毫米厚的腦塊或全腦進行三維成像，清晰呈現(xiàn)皮層和紋狀體的血管網(wǎng)絡(luò)，甚至能分辨直徑僅數(shù)微米的毛細血管。

03 三維成像揭示阻塞動態(tài)：從“局部卡頓”到“全局癱瘓”
通過對不同再灌注時間（0.5小時、2小時、6小時）的小鼠大腦成像，發(fā)現(xiàn)：
阻塞范圍隨時間擴大 ：從下游毛細血管逐漸向上游小動脈蔓延，6小時時阻塞血管體積較0.5小時增加近3倍；

阻塞位置多樣化：不僅發(fā)生在有平滑肌細胞標(biāo)記（αSMA抗體）的小動脈，也出現(xiàn)在無平滑肌的毛細血管，且毛細血管阻塞處的管腔直徑顯著縮小。

04 中性粒細胞的“幫兇”角色：擠窄血管而非堵死通道
以往研究認(rèn)為中性粒細胞像“塞子”一樣直接栓塞毛細血管，但朱丹團隊的三維成像發(fā)現(xiàn)：

多數(shù)阻塞點無中性粒細胞：在78個阻塞點中，56個未見中性粒細胞，說明栓塞并非主要機制；

中性粒細胞加劇管腔狹窄：在有中性粒細胞的阻塞點，細胞被壓縮成“爪狀”，緊貼狹窄的血管壁，且周圍血管壁細胞（如周細胞）的細胞核呈現(xiàn)收縮形態(tài)。進一步實驗顯示，用抗體清除中性粒細胞后，毛細血管直徑恢復(fù)正常，阻塞程度顯著減輕。

用抗Ly6G抗體治療后I/R后缺血核心和腦微循環(huán)中中性粒細胞的微血管阻塞減少

 血管直徑的量化

創(chuàng)新與亮點

01 從“平面”到“立體”：破解腦深部成像難題
傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡只能觀察皮層表面血管，而臨床中風(fēng)患者的深部核團（如紋狀體）常受累更重。本研究通過iDISCO+透明化和全腦三維成像，首次實現(xiàn)了對大腦深層微血管的系統(tǒng)性分析，發(fā)現(xiàn)紋狀體阻塞程度是皮層的2倍以上，為解釋臨床“大血管通而深部組織仍梗死”提供了直接證據(jù)。
02 從“靜態(tài)”到“動態(tài)關(guān)聯(lián)”：細胞-血管互作一目了然
結(jié)合免疫標(biāo)記（如αSMA區(qū)分動脈/毛細血管、Ly6G標(biāo)記中性粒細胞）和三維重建，研究團隊能精準(zhǔn)定位阻塞點與細胞的關(guān)系。例如，通過疊加血管（紅/綠）、中性粒細胞（紫）和細胞核（藍）的信號，清晰看到中性粒細胞如何卡在狹窄的毛細血管中，以及周細胞收縮如何“掐窄”血管——這種“空間關(guān)聯(lián)分析”是傳統(tǒng)二維切片無法實現(xiàn)的。
03 從“現(xiàn)象描述”到“機制突破”：重新定義中性粒細胞作用
該研究推翻了“中性粒細胞主要通過栓塞導(dǎo)致無復(fù)流”的傳統(tǒng)觀點，證實其核心危害是通過釋放活性氧等物質(zhì)，加劇周細胞收縮和血管狹窄。這為靶向治療提供了新方向：相比“清除中性粒細胞”，“抑制周細胞收縮”或“改善血管彈性”可能更有效。

總結(jié)與展望
朱丹團隊的這項研究，通過“雙標(biāo)記+透明化+三維成像”的組合拳，為缺血性中風(fēng)的微血管研究打開了新視野。其核心價值不僅在于揭示了“血管狹窄+中性粒細胞協(xié)同致病”的機制，更在于提供了一套可重復(fù)、可量化的技術(shù)平臺——未來可用于：

藥物研發(fā)：快速評估抗狹窄或抗中性粒細胞藥物對微血管的改善效果；

基礎(chǔ)研究：解析其他神經(jīng)疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ。┲械奈⒀墚惓＃?/span>

臨床轉(zhuǎn)化：結(jié)合熒光分子成像技術(shù)，探索活體三維微血管成像的可能性。

當(dāng)然，目前該技術(shù)仍需優(yōu)化（如縮短透明化時間、提升單細胞分辨率），且小鼠模型與人類中風(fēng)的差異需進一步驗證。但毫無疑問，這種“眼見為實”的三維成像策略，正在改寫我們對大腦微觀世界的認(rèn)知。隨著技術(shù)迭代，或許有一天，醫(yī)生能通過無創(chuàng)三維成像實時監(jiān)測患者的微血管狀態(tài)，讓“無復(fù)流”不再成為中風(fēng)治療的“盲區(qū)”。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Li Y, Xu J, Yu T, Zhu J, Xuan A, Liu X, Wang P, Li D, Zhu D. A labeling strategy for the three-dimensional recognition and analysis of microvascular obstruction in ischemic stroke. Theranostics. 2023 Jan 1;13(1):403-416. 

DOI:10.7150/thno.76879.