引言：
低輸入RNA-Seq工作流程的試劑和反應(yīng)體積的小型化和縮小，使研究人員能夠在低樣本輸入和增加樣本數(shù) 量的情況下工作。隨著反應(yīng)體積的減少，試劑體積的準(zhǔn)確傳遞成為保持?jǐn)?shù)據(jù)質(zhì)量和技術(shù)重復(fù)性的關(guān)鍵步驟。

我們展示用于測序和Illumina Nextera?XT工作流的Clontech SMART-Seq?v4 Ultra?低輸入RNA試劑盒的 小型化結(jié)果，使用緊湊的桌面微流體分配技術(shù)生成高質(zhì)量的RNA- seq樣本。

材料及方法：
SMART-Seq v4 Ultra低輸入RNA試劑盒
SMART?技術(shù)(圖1)是基于非模板核苷酸，當(dāng)其在cDNA合成過程中達(dá)到mRNA的5 ‘端時(shí)，由基于mmlv的 逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)添加。當(dāng)一個特殊設(shè)計(jì)的帶有與這些非模板核苷酸互補(bǔ)序列的SMART寡核苷酸與cDNA第一 鏈雜交時(shí) ，就會發(fā)生模板切換。

RT從使用mRNA作為模板轉(zhuǎn)變?yōu)槭褂肧MART 寡核苷酸進(jìn)行進(jìn)一步的cDNA合成。這確保了mRNA的5‘端 被捕獲，并允許特定的序列被添加到cDNA的每個端，以更簡單的擴(kuò)增和豐富全長cDNA。

圖1.SMART cDNA合成技術(shù)。

Mantis低通芯片分配
MANTIS?是一個易于編程、低微量移液、低死腔容積、非接觸式試劑分液設(shè)備。MANTIS可以配置多達(dá)24種 不同的試劑，有100nl – 2 ml的分配范圍，可以分配任何體積到任何孔中，并兼容任意孔板，高達(dá)1536孔。

為了減少死死腔容積，試劑可以直接連接到微流控芯片。更可通過使用移液槍頭直接插在芯片上進(jìn)一步減小 死體積到只有6μL。這個功能是分配NGS樣品準(zhǔn)備試劑的理想選擇。

圖2. MANTIS?微流體分配系統(tǒng)

cDNA合成和庫準(zhǔn)備
10ng等份的小鼠大腦總RNA和等份1000個細(xì)胞(K562細(xì)胞系)和陰性對照樣品使用標(biāo)準(zhǔn)全體積反應(yīng)條件處 理，并與使用SMART-Seq v4超低輸入RNA試劑盒縮小反應(yīng)體積處理的樣本進(jìn)行對比。采用8個循環(huán)的PCR 擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物試劑體積如表1所示。使用片段分析儀(AATI)對生成的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行了表征，并通過 PIcoGreen?assay進(jìn)行了定量。

表1. 全反應(yīng)和小型化 cDNA合成反應(yīng)試劑體積。
使用MANTIS低通芯片分配緩沖液、引物和預(yù)混液試劑。

使用縮減規(guī)模的反應(yīng)體積的Nextera XT 片段文庫試劑盒 (Illumina) )從 100 pg 等份的擴(kuò)增 cDNA 產(chǎn)物中制備 Illumina 測序文庫，如表 2 所示。與標(biāo)準(zhǔn)完整反應(yīng)體積進(jìn)行比較用于說明證實(shí)。小型化 Nextera XT 反應(yīng)條件用于全規(guī)模和小型化 cDNA 合成樣品。我們使用12個循環(huán)的PCR擴(kuò)增測序文庫。

表 2. Nextera XT 片段文庫制備試劑體積。使用 MANTIS? 低通量芯片分配試劑。

小型化的cDNA合成和文庫制備條件用于分別使用8、11、14、17個PCR周期處理1000個、100個、10個、1個 細(xì)胞樣品的遞減輸入細(xì)胞（K562），如果樣品中含有細(xì)胞，從減少的數(shù)量中擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物。

測序與數(shù)據(jù)分析
合并索引的樣品，并使用MiSeq進(jìn)行2x75 bp讀數(shù)測序。用CLC Genomics Workbench（8.5.1版）對讀數(shù)進(jìn) 行調(diào)整，并使用CLC將其定位到rRNA和線粒體基因組。然后用CLC將未映射的讀數(shù)映射到人類基因 組(hg19)和小鼠基因組(mm10)，通過RefSeq掩蔽，產(chǎn)生唯一的映射讀數(shù)和%讀數(shù)，映射到RefSeq注釋， 包括外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)域。每個文中鑒定的基因數(shù)由RPKM≥0.1的基因數(shù)確定。映射到RefSeq 后，使用CLC Genomics Workbench獲得了不同基因的表達(dá)水平。

結(jié)果：
cDNA合成

圖3.電泳圖，顯示了用于全反應(yīng)和小型化反應(yīng)的cDNA產(chǎn)物的等量分布。

表3.用Pico-Green測定測得的cDNA產(chǎn)物產(chǎn)量（ng/μl）。

測序庫準(zhǔn)備

圖4.最終片段庫的電泳圖顯示了細(xì)胞和RNA輸入樣本的全反應(yīng)和小規(guī)模的 cDNA合成反應(yīng)的等量分布。

表3.用Pico-Green測定測得的cDNA產(chǎn)物產(chǎn)量（ng /μl）。

測序結(jié)果-全反應(yīng)和小型化反應(yīng)的比較

表4. 全反應(yīng)和小型化反應(yīng)條件的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析比較。

表5.用Pico-Green法測定cDNA產(chǎn)物收率(ng/?μl)。

表6. 使用小型化樣品準(zhǔn)備條件減少細(xì)胞數(shù)量的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析。

總結(jié)：
使用Formulaonx Mantis微流控分液系統(tǒng)時(shí)，使用Clontech SMART-Seq v4 Ultra低輸入RNA試劑盒減少 用于cDNA合成的試劑量，其結(jié)果可媲美全反應(yīng)體積。從按比例縮小的反應(yīng)體積的工作流程擴(kuò)增的cDNA的平均產(chǎn)量與細(xì)胞和總RNA的輸入樣本兼容。RNA-Seq數(shù)據(jù)分析指標(biāo)在全反應(yīng)和小型化反應(yīng)條件之間具有可比性。高產(chǎn)量cDNA合成化學(xué)與高精度小劑量試劑分配相結(jié)合，提供了非常適合大規(guī)模RNA-Seq研究的工作流程。