Light文獻(xiàn)分享――無旁瓣超分辨成像：軸向分辨率突破至26 納米_abio生物試劑品牌網(wǎng)
該研究由潘斌雄、王保菊、詹求強(qiáng)等學(xué)者共同完成，相關(guān)成果以“Sidelobe-free deterministic 3D nanoscopy with λ/33 axial resolution”為題，于2025年發(fā)表在國(guó)際頂級(jí)光學(xué)期刊《Light:Science&Applications》上。
重要發(fā)現(xiàn)
01非線性激發(fā)與光學(xué)干涉的協(xié)同突破
UNEx-4Pi技術(shù)的底層邏輯源于對(duì)“光學(xué)非線性效應(yīng)”的極致利用。傳統(tǒng)4Pi顯微術(shù)通過雙物鏡干涉壓縮軸向點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF），但固有旁瓣強(qiáng)度可達(dá)主峰值的60%，嚴(yán)重影響成像質(zhì)量。而UNEx-4Pi引入鑭系摻雜上轉(zhuǎn)換納米顆粒（如Yb3?/Pr3?共摻雜納米顆粒），其光子雪崩效應(yīng)可產(chǎn)生高達(dá)35階的光學(xué)非線性響應(yīng)。理論模擬顯示，當(dāng)非線性階數(shù)N>10時(shí)，4Pi干涉場(chǎng)的旁瓣強(qiáng)度可被抑制至主峰值的0.1%以下，且軸向分辨率公式從傳統(tǒng)的dz≈λ/3n優(yōu)化為dz≈λ/3n√N(yùn)，即非線性階數(shù)越高，分辨率提升越顯著。實(shí)驗(yàn)中，團(tuán)隊(duì)采用852nm連續(xù)激光激發(fā)18nm的PA納米顆粒，通過鏡面輔助的單物鏡雙焦自干涉策略，成功獲得了軸向26nm、橫向53nm的超分辨率聚焦斑，且在觀測(cè)范圍內(nèi)完全消除了旁瓣。這一結(jié)果打破了傳統(tǒng)認(rèn)知——無需復(fù)雜的數(shù)學(xué)反卷積算法，僅通過物理機(jī)制即可實(shí)現(xiàn)“旁瓣清零”。
在 3D超分辨率生物成像實(shí)驗(yàn)中，UNEx-4Pi展現(xiàn)出卓越的光學(xué)切片能力。當(dāng)對(duì)分布于鏡面上的PA納米顆粒進(jìn)行成像時(shí)，傳統(tǒng)LSM因衍射極限限制，無法分辨間距100nm的顆粒；4Pi顯微術(shù)雖壓縮了軸向PSF，但旁瓣導(dǎo)致圖像模糊；而UNEx-4Pi不僅清晰分辨出相鄰顆粒，其軸向分辨率經(jīng)實(shí)測(cè)達(dá)26nm，較LSM的1277nm提升近50倍。進(jìn)一步對(duì)BSC-1細(xì)胞的核膜進(jìn)行標(biāo)記成像時(shí)，UNEx-4Pi在軸向32nm分辨率下，無需后期處理即可清晰呈現(xiàn)核膜的精細(xì)結(jié)構(gòu)，而傳統(tǒng)4Pi與低階非線性技術(shù)則因旁瓣殘留或分辨率不足，無法分辨亞100nm的細(xì)節(jié)。這種“即拍即得”的超分辨率能力，得益于PA納米顆粒的抗光漂白特性與UNEx-4Pi的低光毒性設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)中連續(xù)兩小時(shí)的活細(xì)胞成像未觀察到明顯光損傷。
03 從雙物鏡到單鏡單光束的極簡(jiǎn)升級(jí)
傳統(tǒng)4Pi顯微術(shù)依賴雙物鏡與多光路精準(zhǔn)對(duì)齊，不僅硬件成本高昂，還需hourly校準(zhǔn)。UNEx-4Pi通過“鏡面反射替代雙物鏡”的設(shè)計(jì)，將系統(tǒng)簡(jiǎn)化為“單物鏡+SLM相位調(diào)制+鏡面”的結(jié)構(gòu)，利用空間光調(diào)制器（SLM）生成雙焦相位圖案，經(jīng)鏡面反射后形成干涉場(chǎng)，等效于傳統(tǒng)4Pi的雙物鏡聚焦效果。這種設(shè)計(jì)帶來了驚人的穩(wěn)定性，當(dāng)焦點(diǎn)偏差達(dá)1個(gè)波長(zhǎng)（850nm）時(shí)，傳統(tǒng)4Pi的旁瓣強(qiáng)度會(huì)升至主峰值的80%，而UNEx-4Pi因超高非線性效應(yīng)，仍能維持旁瓣強(qiáng)度<0.1%。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其軸向動(dòng)態(tài)掃描范圍達(dá)12μm，足以覆蓋貼壁生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，且無需軸向移動(dòng)樣本臺(tái)，僅通過改變SLM圖案即可實(shí)現(xiàn)3D成像，大幅提升了系統(tǒng)實(shí)用性。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01旁瓣消除的物理革命
首次在真實(shí)空間中通過純物理手段（而非算法）根除4Pi顯微術(shù)的旁瓣難題。傳統(tǒng)技術(shù)中，即使結(jié)合雙光子激發(fā)（2PE），旁瓣高度仍達(dá)5%，而UNEx-4Pi利用35階非線性效應(yīng)，將旁瓣壓制至“零觀測(cè)”水平，從根本上解決了成像對(duì)比度與光漂白問題。
相較于isoSTED需六束激光+雙物鏡的復(fù)雜配置，UNEx-4Pi僅用單物鏡、單束低功率連續(xù)激光（852nm CW）與一面反射鏡，硬件成本降低60%以上，且無需頻繁校準(zhǔn)，系統(tǒng)穩(wěn)定性提升10倍以上。
03 分辨率與實(shí)用性的雙重躍升
軸向 λ/33（26nm）的分辨率不僅超越了現(xiàn)有單物鏡技術(shù)，其“低功率+抗光漂白”特性更適用于活細(xì)胞長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。例如，在BSC-1細(xì)胞成像中，UNEx-4Pi以100μs/像素的掃描速度，實(shí)現(xiàn)了核膜結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)捕捉，而傳統(tǒng)MINFLUX等技術(shù)因依賴高強(qiáng)度激光，難以完成類似觀測(cè)。
總結(jié)與展望
UNEx-4Pi以“非線性光學(xué)+矢量場(chǎng)調(diào)制”的創(chuàng)新思路，重新定義了超分辨率成像的技術(shù)邊界。從科學(xué)價(jià)值看，它首次證明了通過光學(xué)非線性效應(yīng)可在遠(yuǎn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)物理空間的無旁瓣聚焦，為研究光與物質(zhì)的納米級(jí)相互作用提供了“精準(zhǔn)探針”；從應(yīng)用層面，其單光束、低光毒性的特性，使其在活細(xì)胞動(dòng)態(tài)追蹤、單分子定位等領(lǐng)域極具潛力——例如，文中展示的核膜32nm軸向分辨率，已能滿足染色質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的需求。未來，UNEx-4Pi的發(fā)展將聚焦兩大方向，一是集成自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)，克服樣本厚度帶來的像差，將成像深度從當(dāng)前的12μm擴(kuò)展至100μm以上，以適應(yīng)組織級(jí)三維成像；二是開發(fā)更快響應(yīng)的光子雪崩材料，將掃描速度提升至毫秒級(jí)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器動(dòng)態(tài)過程的實(shí)時(shí)記錄。此外，其超高非線性聚焦特性還可延伸至納米光刻、光存儲(chǔ)等領(lǐng)域，例如基于λ/33的聚焦精度，有望實(shí)現(xiàn)亞50nm的3D光刻線條，為下一代芯片制造提供技術(shù)儲(chǔ)備。這項(xiàng)技術(shù)不僅是超分辨率成像的一次突破，更可能成為連接光學(xué)基礎(chǔ)研究與納米技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵橋梁。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Pan B, Wang B, Ni Y, Zhao Q, Wang Y, CAI Y, Zhan Q. Sidelobe-free deterministic 3D nanoscopy with λ/33 axial resolution. Light Sci Appl. 2025 Apr 21;14(1):168.
DOI:10.1038/s41377-025-01833-x.
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