復合模式層析在雙抗純化中的多重策略_abio生物試劑品牌網
雙特異性抗體（BsAbs）以其多靶點機制在腫瘤免疫治療中展現(xiàn)巨大潛力。截至2024年底，已有19款BsAb藥物上市，300多項臨床試驗在全球范圍內開展。
由于雙特異性抗體的巨大治療潛力促使迄今為止已開發(fā)出超過50種不同的重組雙特異性抗體結構。其可大致分為兩類：不含F(xiàn)c區(qū)的（Non IgG like BsAb）和含F(xiàn)c區(qū)域（IgG like BsAb），含F(xiàn)c區(qū)域又分為對稱性(Symmetric)和非對稱性雙抗（Asymmetric）。
但BsAbs獨特的結構復雜性，也帶來了大量產品相關雜質，如同源二聚體（homodimer）、輕鏈缺失產物（LC-missing byproduct）、半抗（half antibody）以及聚集體等。由于這些雜質與目標分子的物理化學性質接近，常規(guī)的離子交換層析往往難以實現(xiàn)有效分離。
為此，復合模式層析（Mixed-Mode Chromatography）作為一種集多種作用力于一體的新型分離純化介質，正在雙抗純化中發(fā)揮關鍵作用。
什么是復合模式層析？博格隆研發(fā)的Diamond MMC Mustang為代表的復合模式介質，具有以下多重機制：
?弱陽離子交換作用
?氫鍵作用
?疏水作用
可廣泛適用于聚集體、片段、輕鏈缺失產物、半抗、同源二聚體等復雜雜質的去除。
工藝實證案例 去除聚集體與片段?分子：Bispecific antibody
?樣品：Protein A eluate (pH adjusted to 5.5)
?Buffer：50 mM NaAc-HAc, pH 5.5；50 mM NaAc-HAc, 1 M NaCl, pH 5.5
?上樣載量：35 g/L 與 80 g/L
?梯度：0-100% B 20CV線性鹽濃度遞增
結果：Diamond MMC Mustang在不同載量下分辨率穩(wěn)定，媲美進口對標產品
Fig.1 Diamond MMC Mustang與某進口介質分離純化層析圖譜
Fig.2 Diamond MMC Mustang與某進口介質分離后樣品的SDS-PAGE結果
去除輕鏈缺失產物?分子：Symmetric WuXiBody
?分離原理：PI差異（雙抗與LC-missing byproduct相差0.21）→結合力不同 → 成功分離
?樣品：Protein A eluate (pH adjusted to 6.0)
?Buffer：40 mM phosphate buffer, pH 6.0；40 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 6.0
?梯度：0-100% B 20CV線性鹽濃度遞增
結果：實現(xiàn)雙抗與LC-missing byproduct的分離，由SDS-PAGE圖可峰尾為LC-missing byproduct。
Fig.3 復合陽離子介質分離LC-missing byproduct層析圖譜以及質控
線性pH梯度去除半抗與homodimer?分子：Bispecific antibody(Asymmetric IgG-like knobs-into-holes)
?分離原理：半抗、hole-hole homodimer、bsAb、聚集體在復合性陽離子上的結合力差異
?樣品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)
?Buffer：20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mMTris, 20mM glycine, pH 5.5；20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mM Tris, 20mM glycine, pH10.0
?梯度：0-100% B 20CV線性pH遞增
結果：由層析圖譜和SDS-PAGE圖可知成功分離半抗、homodimer與聚集體
Fig.4 復合陽離子介質分離半抗、homodimer層析圖譜以及質控
利用疏水作用去除片段與聚集體?分子：Bispecific antibody
?分離原理：高鹽結合，低鹽洗脫 → 去除片段與聚集體
?樣品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)
?Buffer：50 mM Tris-HAc, 1 M (NH4)2SO4, pH 7.0；50 mM Tris-HAc, pH 7.0
?上樣載量：30 g/L
?梯度：0-100% B 20CV 鹽濃度遞減（1M (NH?)?SO? → 0）
結果：成功分離片段與聚集體，與進口對標產品表現(xiàn)一致
Fig.5 復合陽離子介質分離片段、聚集體層析圖譜以及質控
Diamond MMC Mustang批次間一致性評估為了評估填料的批次間的一致性，本實驗使用三個不同批次的Diamond MMC Mustang介質分別裝填的色譜柱，在相同條件下進行了三次純化。
?由疊加層析圖譜，可知三批次洗脫圖譜重現(xiàn)性高，分離效果優(yōu)異，,三個批次性能高度一致，如下圖所示
?三批次5%DBC也表現(xiàn)出一致性（批次1、2和3的5%DBC分別為94、94和95 mg/ml）
?三批次洗脫液質量、收率表現(xiàn)一致
Fig.6 Diamond MMC Mustang介質三個批次的層析圖譜
小結復合模式層析作為雙抗下游純化的重要補充手段，憑借其多種作用機制，能有效解決常規(guī)層析難以分離的雜質問題。它不僅為產品質量提升提供保障，也為工藝流程簡化提供了新思路。
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參考文獻
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