豬偽狂犬病毒（PRV）gE 蛋白的結構、功能與研究應用解析_abio生物試劑品牌網
一、gE 蛋白的分子特征與生物學定位
1. 基因與氨基酸序列特征
1. 病毒入侵與擴散的關鍵因子
1. 表達系統的選擇 表達系統 優勢 純化要點 昆蟲細胞 - 桿狀病毒 糖基化接近天然，適合疫苗抗原 融合 His 標簽（胞外區截短表達），Ni-NTA 層析結合 SEC 純化 哺乳動物細胞（HEK293） 糖基化復雜，適合結構研究 無血清培養，上清通過 Protein A 柱（若融合 IgG Fc 標簽） 原核細胞（E. coli） 成本低，適合診斷抗原 需去除信號肽和跨膜區，優化誘導條件減少包涵體形成 2. 典型純化流程（以昆蟲細胞表達為例）
步驟 1：重組蛋白表達與收獲
1. 鑒別診斷的核心標志物
1. 基因與氨基酸序列特征
PRV gE 蛋白（糖蛋白 E，Glycoprotein E）由病毒基因組 UL44 基因編碼，具有以下特點：
- 全長序列：約 530-550 個氨基酸，含 N 端信號肽（18-22 個氨基酸）、胞外區（約 470 個氨基酸）、跨膜區（22 個氨基酸）和胞內尾（30-40 個氨基酸）；
- 保守結構域：胞外區含 6 個保守半胱氨酸殘基（形成 3 對二硫鍵），C 端含免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM），參與病毒胞內運輸。
- 三維構象：gE 以同源二聚體形式存在于病毒包膜，電鏡下呈 “Y 型”，胞外區由 β 折疊和 α 螺旋交替形成核心支架；
- 糖基化位點：含 8-10 個 N - 糖基化位點（如 Asn150、Asn280、Asn400），糖基化程度影響病毒感染力和免疫逃逸能力；
- 變異株差異：近年流行的 PRV 變異株（如 China 2012-like 株）在胞外區新增 2 個糖基化位點（Asn350、Asn450），可能增強其致病性。
- 理論分子量：未糖基化的 gE 多肽鏈約 60 kDa；
- 天然狀態分子量：因高度糖基化，PRV 野毒株 gE 在 SDS-PAGE 中遷移至 90-110 kDa，疫苗株（如 Bartha-K61）gE 約 85 kDa；
- 表達定位：gE 是 PRV 的晚期蛋白（感染后 12-24 h 高表達），主要定位于病毒包膜、宿主細胞膜及高爾基體，參與病毒出芽和細胞間傳播。
1. 病毒入侵與擴散的關鍵因子
- 宿主受體結合：gE 可與宿主細胞表面的糖胺聚糖（GAGs）結合，輔助 gD/gB/gH/gL 復合物介導病毒與細胞膜融合；
- 細胞間傳播：gE 與 gI 蛋白形成復合物（gE/gI），通過 “順行運輸” 機制促進病毒在神經元突觸間擴散，是 PRV 嗜神經性的決定因素之一。
- 抑制宿主免疫應答：gE 可下調宿主細胞 MHC I 類分子表達，減少 CTL 細胞對感染細胞的識別；
- 毒力相關性：敲除 gE 基因的 PRV 變異株（如缺失株 SA215）毒力顯著減弱，常用于基因缺失疫苗研發。
1. 表達系統的選擇 表達系統 優勢 純化要點 昆蟲細胞 - 桿狀病毒 糖基化接近天然，適合疫苗抗原 融合 His 標簽（胞外區截短表達），Ni-NTA 層析結合 SEC 純化 哺乳動物細胞（HEK293） 糖基化復雜，適合結構研究 無血清培養，上清通過 Protein A 柱（若融合 IgG Fc 標簽） 原核細胞（E. coli） 成本低，適合診斷抗原 需去除信號肽和跨膜區，優化誘導條件減少包涵體形成 2. 典型純化流程（以昆蟲細胞表達為例）
步驟 1：重組蛋白表達與收獲
- 構建 pFastBac 載體（含 gE 胞外區基因 + His 標簽），轉染 Sf9 細胞后感染重組桿狀病毒，27℃培養 72 h；
- 收集細胞培養上清（分泌型 gE）或超聲破碎細胞（胞內 gE），4℃離心（12000×g，30 min）取上清。
-
Ni-NTA 柱純化
- 平衡液：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）+ 150 mM NaCl + 10 mM 咪唑；
- 洗脫液：含 250 mM 咪唑的平衡液，收集洗脫峰組分；
- 脫鹽：PD-10 柱更換為 PBS（pH 7.4）。
-
離子交換層析（IEX）
- 進一步去除雜蛋白：使用 Q Sepharose 柱（陰離子交換），梯度 NaCl（0-1 M）洗脫，收集 gE 組分（純度≥95%）。
- 若 gE 在大腸桿菌中形成包涵體：
- 6 M 鹽酸胍溶解包涵體，離心取上清；
- 透析復性（含 10% 甘油 + 0.5 mM 氧化谷胱甘肽），超濾濃縮至 1-2 mg/mL。
1. 鑒別診斷的核心標志物
- gE-ELISA 檢測方法：
- 原理：PRV 野毒株感染豬會產生抗 gE 抗體，而 Bartha-K61 等疫苗株因 gE 基因缺失（ΔUL44）不表達 gE，可通過檢測 gE 抗體區分野毒感染與疫苗免疫；
- 應用：歐盟標準診斷方法（如 cELISA）以純化 gE 為包被抗原，特異性達 98% 以上。
- gE/gI 雙缺失疫苗：如國內研發的 PRV TJ-gE?/gI?株疫苗，刪除 gE/gI 基因后毒力減弱，但保留 gB/gD 等免疫原性蛋白，免疫豬可產生高效中和抗體（滴度≥1:2000），且不干擾 gE 抗體檢測；
- 反向遺傳技術改造：通過同源重組刪除 gE 基因，結合 gB/gD 抗原優化，開發多價亞單位疫苗。
- 糖基化異質性挑戰
- 問題：不同表達系統產生的 gE 糖鏈結構差異大（如昆蟲細胞高甘露糖型、哺乳動物細胞復雜型），影響診斷抗體識別；
- 解決方案：采用糖基化缺陷型細胞系（如 HEK293 GnTI?細胞）表達 gE，獲得均一糖鏈結構，或通過酶法去除天然糖鏈后重修飾。
- gE/gI 復合物的結構解析
- 冷凍電鏡（Cryo-EM）研究顯示，gE/gI 復合物通過 DⅠ 區形成 “鉗狀” 結構，介導病毒在神經元間的順行運輸，靶向該復合物的單克隆抗體可阻斷病毒擴散（中和效價 IC??=10 ng/mL）；
- 基于結構的藥物設計：開發小分子抑制劑結合 gE/gI 界面，抑制病毒細胞間傳播。
PRV gE 蛋白因其在病毒致病性和免疫逃逸中的關鍵作用，成為診斷與疫苗研發的核心靶點。純化 gE 時需根據應用場景選擇表達系統：診斷用抗原優先原核表達（成本低），疫苗抗原需真核表達（糖基化天然）。未來，結合結構生物學（如 gE/gI 復合物與宿主受體的互作機制）和基因編輯技術，可進一步開發高效鑒別診斷試劑和廣譜疫苗。如需特定毒株（如 HB1、AJ 株）gE 的序列分析或純化優化，可提供毒株信息進行定制化方案設計。
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