阿爾茨海默癥 (AD) 屬于老年癡呆癥的一種，是一種常見的神經退行性疾病，其機制主要涉及 β-淀粉樣蛋白斑塊 (Amyloid-β, Aβ) 等。本期小 M 給大家介紹幾種針對 Aβ 的生物檢測方法！ 

Section.01
Aβ 的常見生物檢測方法

針對 Aβ 檢測的生物實驗方法有多種，從 ELISA 和 Western Blot 的精準定量，到質譜分析的高分辨率檢測，再到 IHC 的組織分布觀察，這些技術揭示關鍵蛋白 Aβ 的奧秘，助力 AD 研究!

 
Section.02
酶聯免疫吸附測定

研究表明，AD 患者腦脊液 (CSF) 的 Aβ42 水平的變化一般發生在臨床癥狀出現前 10-20 年，而血液中與 AD 相關的生物標志物豐度非常低，因此需要超靈敏的檢測技術來量化 Aβ42 水平。通過 酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 和其他常規免疫測定法測定顯示，AD 患者 CSF 中的 Aβ42 濃度降低，這可能與大腦中的血腦屏障和清除系統有關。而利用免疫磁還原 (IMR) 技術檢測顯示 AD 早期患者血液 Aβ42 水平升高，特別是 AD 引起的輕度認知障礙 (圖 1)^[1]。

圖 1. 對照組 (CONT)  和 AD 組血漿 Aβ42 和 CSF Aβ42 水平呈負相關^[1]。

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ELISA 基本原理：將一定濃度的抗原或抗體通過物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待測樣本，通過酶標物顯色的深淺間接反映被測抗原或者抗體是否存在或量的多少。

IMR 基本原理：利用分散在水中之披覆有抗原或抗體的磁性粒子與待測生物分子結合后，形成磁性粒子叢集或造成磁性粒子變大變重，再量測因這些磁性粒子叢集或大磁性粒子的形成而改變試劑磁性大小，從而檢測出待測生物分子濃度的新穎檢測方式。

Section.03
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

Aβ 寡聚體是在 Aβ 聚集過程中早期的致病分子形式和神經毒性物質。由于 Aβ 寡聚體異質且瞬時存在，光誘導未修飾蛋白質交聯 (PICUP) 反應可有效的交聯得到 Aβ40/Aβ42 寡聚物，再通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 量化其相對豐度。Aβ40 主要通過二聚體至四聚體進行寡聚化，而 Aβ42 主要通過五聚體和六聚體進行寡聚化^[2][3]，且隨著寡聚體增加而表現出強度降低 (圖 2a)。鑒于 SDS 影響 Aβ 的寡聚化狀態，電噴霧電離質譜法 (ESI-IM-MS) 進一步準確表征低豐度 Aβ 寡聚體的分布 (圖 2b)^[4]。

圖 2. Aβ42 主要通過五聚體和六聚體進行寡聚化^[4]。
a. 通過 SDS-PAGE 分析表征 LMW 和 LMW_CL Aβ40 和 Aβ42 低聚物分布。b. LMW Aβ42 的 ESI-IM-MS 譜圖 。(M = 單體，D = 二聚體，Tr = 三聚體，Te = 四聚體，P = 五聚體，Hex/Hx = 六聚體。)

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PICUP基本原理：利用光能作為催化劑，驅動特定的化學反應，從而在無需修飾蛋白質的情況下實現交聯。

SDS-PAGE基本原理：在 SDS-PAGE 中，加入十二烷基硫酸鈉（SDS）和強還原劑，SDS 破壞蛋白質的氫鍵和疏水相互作用，使其構象改變，而還原劑打開蛋白質內的二硫鍵，使其分解為亞基。根據待測樣品中蛋白質分子量大小的不同，使其在電泳膠中分離。

ESI-IM-MS基本原理：在毛細管的出口處施加高電壓，產生的高電場將從毛細管流出的液體霧化成微小的帶電液滴。隨著溶劑的蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增加，最后液滴分裂成一個或多個帶電離子，從而使分析物以單電荷或多電荷的形式進入氣相變成氣相離子，再檢測產生高電荷離子的質量電荷比。

Section.04
免疫組化

AD 的主要特征是老年斑 (SP) 和 神經原纖維纏結 (NFT) 在脆弱的大腦區域沉積。SP 在神經元內積累，由聚集的 Aβ40/42 肽組成。用 Aβ42 的 C 端特異性抗體對認知障礙受試者中的腦組織染色，可以清晰的看到 AD 患者早期腦部組織顯示出大量的區域特異性神經元內免疫反應性，尤其在海馬/內嗅皮層等區域的錐體神經元中 (圖 3)^[5]。

圖 3. Aβ42 在 AD 患者早期腦部組織中積累^[5]。
a. 神經學正常的 3 歲患者（對照）海馬體 CA4 區域的 Aβ42 染色;只能看到微弱的神經元染色。b. 一名患有唐氏綜合征的 3 歲兒童的明顯 CA4 Aβ42 免疫反應性。c. 79 歲無癡呆患者的 Aβ42 染色 表明內嗅皮層的 II 層神經元（箭頭）有明顯的 Aβ42 細胞內染色。d. 83 歲的認知障礙受試者中，在 Aβ42 (RU) 染色的神經元中明顯缺乏核內 Aβ42 染色; e. 72 歲的晚期 AD 受試者的“神經元”形狀的老年斑 (SP)（箭頭）與更傳統的球形 SP 相鄰；f. 79 歲認知障礙受試者的 CA1 區域顯示神經元內 Aβ42 免疫反應性和明顯的神經元外彌漫性斑塊樣染色 (箭頭)。

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IHC 基本原理：融合免疫學原理 (抗原抗體特異性結合) 和組織學技術 (組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等)，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色，來對組織 (細胞) 內抗原進行定位、定性及定量的研究 (主要是定位)。

Section.05
質譜分析

Aβ40 在 AD 患者體內的豐度是 Aβ42 的 10 倍，但 Aβ42 的神經毒性比 Aβ40 強。用納米 ESI 離子遷移質譜儀檢測 Aβ40 和 Aβ42 的 1：1  混合物（用 FMOC 化學方法合成 Aβ40 和 Aβ42）發現，純 Aβ42 的寡聚化速度比 Aβ40 快得多，導致 Aβ42 快速耗盡 (圖 4a)^[6]。CSF 中 Aβ42 與 Aβ40 的比率有助于評估 AD，但定量受到包括分析前分析物損失等因素的限制。高通量 LCMS/MS 技術可以限制分析物損失，對臨床的 CSF 標本分析顯示 AD 和輕度認知障礙 (MCI) 患者中 Aβ42/Aβ40 比值和 Aβ42 濃度都降低^[15]，進一步證實 Aβ42 的寡聚化是 AD 的重要原因 (圖 4b)。

圖 4. Aβ42/Aβ40 比值和 Aβ42 濃度在 AD 和 MCI 患者中都降低^[7]。
a. Aβ40 和 Aβ42 的 1：1 混合物的負離子質譜^[14]。b. Aβ42/Aβ40（上）和 Aβ42（下）在 AD、MCI、DLB/AD、健康對照、非 AD 癡呆和伴或不伴 AD 的 DLB 中的分布 (MCI：輕度認知障礙；DLB：路易體癡呆)。

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LCMS/MS 基本原理：樣品通過液相色譜分離后的各個組分依次進入質譜檢測器，各組分在離子源被電離，產生帶有一定電荷、 質量數不同的離子。不同離子在電磁場中的運動行為不同，采用質量分析器按不同質荷比（m/z）把離子分開，得到依質荷比順序排列的質譜圖。

Section.06
免疫熒光

神經元內 Aβ42 在 AD 或 DS 切片中具有胞質顆粒免疫反應性^[8]，主要定位于神經元的突觸前，尤其是突觸后隔室內的多泡體中積累，但由于很快被大腦中的小膠質細胞清除，因此不容易觀察到。在唐氏綜合癥 (DS) 星形膠質細胞中使用針對 Aβ42 C 端產生的單克隆抗體進行了免疫熒光顯微鏡觀察，顯示 DS 星形膠質細胞中 Aβ42 呈囊泡狀分布 (圖 5a)^[9]。細胞內 Aβ42 能直接激活 p53 啟動子，導致 p53 依賴性細胞凋亡。此外，氧化 DNA 損傷誘導了豚鼠原代神經元中 Aβ42  的核定位和 p53 mRNA 升高。氧化 DNA 損傷可能誘導 Aβ42 在胞質溶膠中積累，然后依次在激活 p53 級聯反應的細胞核中積累 (圖 5b) ^[10]。

圖 5. Aβ42 呈囊泡狀分布，且氧化 DNA 損傷誘導了 Aβ42 的核定位^[9][10]。
a. 正常 (NL) 和 DS 星形膠質細胞中對 Aβ42 進行免疫熒光檢測 (上)^[9]。b. H₂O₂ 誘導胚胎豚鼠腦細胞中 Aβ42 (綠色) 和 p53 (紅色) 的雙重免疫染色 (下)^[10]。

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IF 基本原理：根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原 (或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及定量 (熒光面積或平均熒光強度等)。

Section.07
流式細胞術

Aβ 肽的異常神經元積累會影響突觸傳遞并導致 AD 大腦的神經退化。其中 Aβ40 和 Aβ42 能擾亂神經元細胞的內吞作用和細胞內運輸。利用分析流式細胞術用 Aβ42 特異性抗體檢測 AD 患者額葉皮層和紋狀體中發生的突觸變化，發現嚴重 AD 患者大腦皮層中 Aβ42 陽性突觸體的數量增加，并在人皮質突觸體中積累 (圖 6a-c)^[11]。此外，Aβ40  通過減少 PC12 細胞對 F-Aβ42 (熒光素標記的 Aβ42) 的攝取來減少 Aβ42 在神經元內積累和溶酶體定位 (圖 6d-f)^[12]。

圖 6. AD 患者大腦皮層中 Aβ42 陽性突觸體的數量增加^[11][12]。
(a-c) 用抗 Aβ42 抗體檢測 AD 患者皮質突觸體中 NFT 分布的 Braak 階段系統，神經炎斑塊密度的 CERAD 評分和 Aβ42 斑塊分布的 Thal 期^[11]。（d）Aβ40 抑制分化的 PC12 細胞中對 F-Aβ42 的攝取細胞內熒光的流式細胞術直方圖顯示 Aβ40 預處理細胞中 F-Aβ42 攝取的抑制；（e）F-Aβ40 的攝取不受 Aβ42 預處理細胞的影響。（f）細胞內熒光的幾何平均值^[12]。

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FC基本原理：利用激光激發帶有熒光標記的微粒，檢測其散射光信號和熒光信號，從而反應微粒的各個參數，并將特定性狀的微粒分選出來。

Section.08
表面等離子體共振

在正常生理條件下， Aβ42 和 Aβ40 肽以 1:9 的比例共存于大腦中。而在家族性 AD 患者的大腦中，該比率通常轉變為 Aβ42 的較高百分比，導致突觸毒性增加。據報道，盡管這兩種肽的化學性質非常相似， Aβ42:Aβ40 比率的微小變化會極大地影響神經毒性寡聚體的形成。利用 SPR 技術表征了不同生物素化的 Aβ42:Aβ40 比率的開始和結束狀態，并證實了 Aβ42 和 Aβ40 可以直接相互作用，并且它們相互影響各自的聚集行為 (圖 7)^[13]。

圖 7. Aβ42 和 Aβ40 直接相互作用^[13]。

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SPR 基本原理：指金屬表面的電子以及周圍介質中的電子，以特殊頻率的共振而產生的一種特殊的電磁波，可以檢測抗原與抗體、DNA 與蛋白、蛋白與蛋白之間的相互作用。

 
參考文獻：
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