研究背景：

抑郁癥是當(dāng)代社會普遍且發(fā)病率上升的精神疾病，與心房顫動（AF）關(guān)聯(lián)密切，AF患者中抑郁癥患病率達(dá)38%-42.7%。流行病學(xué)研究均證實(shí)，抑郁癥是AF發(fā)病、新發(fā)生及復(fù)發(fā)的危險因素，也是導(dǎo)管消融術(shù)后AF復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素。但兩者關(guān)聯(lián)機(jī)制尚不明確，目前僅知P2X7受體是連接因素。本研究基于無偏組學(xué)提出假設(shè)：抑郁狀態(tài)下腦白質(zhì)分泌的N-棕櫚酰甘氨酸，通過Man1a2-AMPK-自噬-NRAP信號軸破壞心房閏盤，進(jìn)而促進(jìn)AF發(fā)生。

N-棕櫚酰甘氨酸由哺乳動物感覺神經(jīng)元分泌，在組織器官中分布差異大，正常時皮膚和腦濃度最高，心臟含量極低，其生理功能尚未被充分探索。本研究發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)可通過α1，2-甘露糖苷酶（Man1a2）作用于心肌閏盤，導(dǎo)致閏盤相關(guān)蛋白NRAP減少。Man1a2是參與真核蛋白N-糖鏈修飾的關(guān)鍵酶，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的活性以劑量依賴方式?jīng)Q定錯誤折疊蛋白的降解途徑，局部濃度越高，蛋白錯誤折疊概率越大，而其在心肌組織中的作用此前未被報道。

基于此，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院梁兆光教授團(tuán)隊(duì)、董增祥教授團(tuán)隊(duì)近期在Europace雜志上發(fā)表"N-palmitoyl glycine mediates depression-associated atrial fibrillation via Man1a2-dependent autophagy and NRAP dysregulation"文章。

研究結(jié)果：

1. 在CUMS誘導(dǎo)的抑郁大鼠中，AF的發(fā)生率增加
為驗(yàn)證抑郁對房顫的影響，選用最常用、可靠且有效的慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（CUMS）嚙齒類抑郁模型。成功建立CUMS抑郁大鼠模型后，超聲心動圖評估顯示，抑郁大鼠左房舒張期內(nèi)徑增大，E/E'升高。體表電生理檢測發(fā)現(xiàn)，抑郁大鼠心房有效不應(yīng)期縮短，房顫誘導(dǎo)率升高。通過ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α表達(dá)升高。

圖1 在CUMS抑郁模型大鼠中，左心房直徑和心房顫動（AF）誘導(dǎo)率均有所增加

2. 在CUMS誘導(dǎo)的抑郁大鼠及伴發(fā)AF的抑郁癥患者中，腦白質(zhì)分泌的血漿及心房組織N-棕櫚酰甘氨酸水平均升高
為識別作用于心臟的神經(jīng)系統(tǒng)代謝物，對抑郁大鼠和對照大鼠血漿進(jìn)行全譜代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)抑郁組代謝物中僅N-棕櫚酰甘氨酸由神經(jīng)系統(tǒng)分泌。經(jīng)LC-MS證實(shí)血漿中該物質(zhì)由腦白質(zhì)分泌。抑郁大鼠心房組織中該物質(zhì)濃度也升高。臨床檢測顯示，伴房顫的抑郁癥患者血漿中N-棕櫚酰甘氨酸含量顯著高于單純抑郁癥患者。表明白質(zhì)分泌的N-棕櫚酰甘氨酸在抑郁促發(fā)房顫中起重要作用。

圖2 在抑郁腦白質(zhì)中分泌的過量N-棕櫚酰甘氨酸作用于心房肌細(xì)胞

3. 在抑郁大鼠中，NRAP的減少可導(dǎo)致心房閏盤破裂
為探究抑郁狀態(tài)下心房組織中促進(jìn)房顫發(fā)生的蛋白變化，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。差異蛋白富集分析顯示，調(diào)控蛋白定位至細(xì)胞表面的蛋白顯著富集，心肌閏盤相關(guān)蛋白亦顯著富集。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠心房肌閏盤破裂及肌漿網(wǎng)擴(kuò)張。通過UniProt篩選出閏盤相關(guān)的NRAP表達(dá)下降最顯著。Western blotting及免疫熒光檢測均證實(shí)抑郁大鼠心房組織中NRAP表達(dá)顯著降低。

圖3 在CUMS模型中，NRAP的減少會導(dǎo)致心房閏盤破裂

4. 在抑郁大鼠的心房中，Man1a2的增加通過AMPK通路導(dǎo)致自噬水平降低
為探究NRAP減少機(jī)制，研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與自噬相關(guān)降解途徑的差異蛋白中Man1a2表達(dá)增加。結(jié)合透射電鏡觀察，推測 Man1a2增加通過AMPK通路抑制自噬，致蛋白合成原料減少，進(jìn)而阻礙NRAP合成。Western blot和免疫熒光檢測證實(shí)，抑郁大鼠心房組織中 Man1a2表達(dá)升高、AMPK激活且自噬水平降低。

圖4 抑郁大鼠心房中Man1a2的增加通過AMPK通路導(dǎo)致自噬水平降低

5. 在體外實(shí)驗(yàn)中，N-棕櫚酰甘氨酸通過AMPK通路抑制自噬，進(jìn)而增加Man1a2并減少NRAP
在HL-1心房肌細(xì)胞中，N-棕櫚酰甘氨酸濃度超20μM具細(xì)胞毒性，其可濃度依賴性升高M(jìn)an1a2表達(dá)。Man1a2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白糖基化中起關(guān)鍵作用，其增加雖提升蛋白折疊效率，卻也提高錯誤折疊概率，按生理需求此時需自噬途徑降解蛋白。但實(shí)驗(yàn)顯示，N-棕櫚酰甘氨酸會使Man1a2增加，同時抑制AMPK介導(dǎo)的自噬，致自噬原料減少，NRAP表達(dá)下降，細(xì)胞免疫熒光亦證實(shí)此現(xiàn)象。這提示，該物質(zhì)可能通過此路徑促進(jìn)房顫。

圖5 當(dāng)將N-棕櫚酰甘氨酸添加到HL-1心房肌細(xì)胞中時，Man1a2表達(dá)增加，AMPK被激活，同時自噬水平和NRAP表達(dá)降低

6. 在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，敲低Man1a2可逆轉(zhuǎn)N-棕櫚酰甘氨酸所致的自噬水平降低及NRAP減少
研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑郁狀態(tài)下腦白質(zhì)分泌的N-棕櫚酰甘氨酸進(jìn)入血液，作用于心房組織，通過升高M(jìn)an1a2表達(dá)激活A(yù)MPK信號通路，抑制自噬，導(dǎo)致閏盤相關(guān)蛋白NRAP表達(dá)下降，引起閏盤破裂，從而促進(jìn)房顫發(fā)生。敲低Man1a2或激活自噬可逆轉(zhuǎn)這一過程，揭示了抑郁促發(fā)房顫的新機(jī)制。

圖6 在體外實(shí)驗(yàn)中，敲低Man1a2后，N-棕櫚酰甘氨酸所致的自噬水平降低和NRAP減少得以逆轉(zhuǎn)

7. Man1a2可作為靶點(diǎn)，用于降低抑郁誘導(dǎo)的AF的發(fā)生
為檢測該通路對心房電活動的影響及是否通過交感 / 副交感神經(jīng)作用，采用多通道電生理標(biāo)測技術(shù)，檢測Langendorff灌流后離體心臟的場電位信號。結(jié)果顯示，抑郁大鼠房顫誘導(dǎo)率和持續(xù)時間顯著增加，而Man1a2敲低組則降低。此外，CUMS抑郁大鼠左房電傳導(dǎo)離散度顯著增加，敲低Man1a2后異常傳導(dǎo)降低。這表明Man1a2可作為降低抑郁模型中房顫發(fā)生的靶點(diǎn)。

圖7 在抑郁大鼠中敲低Man1a2可逆轉(zhuǎn)自噬水平及NRAP

結(jié)論：
本研究證實(shí)，N-棕櫚酰甘氨酸通過升高M(jìn)an1a2表達(dá)，減少心房肌細(xì)胞中AMPK相關(guān)自噬及NRAP表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致閏盤破裂和心房興奮傳導(dǎo)離散度增加，從而促進(jìn)房顫發(fā)生。綜上所述，本研究闡明了腦白質(zhì)分泌的N-棕櫚酰甘氨酸在抑郁誘發(fā)房顫發(fā)病機(jī)制中的作用，為防治抑郁相關(guān)房顫提供了新靶點(diǎn)。

本文通過多通道電生理標(biāo)測技術(shù)對不同組大鼠離體心臟的房顫誘發(fā)率、持續(xù)時間、有效不應(yīng)期以及傳導(dǎo)離散度等指標(biāo)進(jìn)行檢測，直接評估Man1a2敲低對抑郁模型中房顫發(fā)生的影響。