近日，華東理工大學生物工程學院和生物反應器工程國家重點實驗室葉邦策教授和尤迪副教授為共同通訊作者、符瑜博士為第一作者在微生物學領域著名期刊《mBio》上發表題為《A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria》的科研成果。研究通過ChIP-seq等分析揭示乙酰磷酸（Acetyl Phosphate, AcP）依賴的乙酰化修飾網絡在放線菌（Actinobacteria）中調控環二腺苷酸單磷酸（cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-AMP）穩態的分子機制。研究以紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，S. erythraea）為模型，揭示AcP通過乙酰化修飾影響兩種關鍵蛋白：二腺苷酸環化酶（Diadenylate Cyclase, DisA）和其轉錄抑制因子DasR，從而調控c-di-AMP合成與降解，維持細胞內c-di-AMP穩態。其調控機制在放線菌中高度保守，并可能對細胞的生長、發育和抗生素合成產生重要影響。
 

標題：A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria（乙酰磷酸依賴的修飾網絡調控放線菌中c-di-AMP穩態） 發表時間：2024-07-09
發表期刊：mBio
影響因子：IF6.4/Q1
技術平臺：ChIP-seq等
 
本研究提出一個由乙酰磷酸（AcP）調控的網絡，該網絡通過DisA和DasR這兩個不同的底物來負責c-di-AMP穩態。研究揭示了AcP誘導的乙酰化通過破壞蛋白質多聚體化來調控，從而通過DisA的K66位點乙酰化抑制c-di-AMP合成；而DasR的K78位點乙酰化則消除對disA的轉錄抑制。研究驗證了AcP通過介導平衡c-di-AMP穩態發揮關鍵生理作用。進一步的研究表明，乙酰化的DisA和DasR發生了構象變化，這些變化在分化過程中發揮著至關重要的作用。鑒于AcP誘導的乙酰化在響應環境脅迫時的廣泛分布以及所鑒定關鍵位點的高度保守性，研究人員提出c-di-AMP穩態調控可能是放線菌中心回路的一個基本特性，從而實現對細胞生理的整體調控。  
易小結
c-di-AMP是一種在細菌中廣泛存在的核苷酸第二信使，參與調控細胞壁完整性、滲透壓平衡、生物膜形成等多種生物學過程。易基因參與的前期研究揭示了c-di-AMP與紅色糖多孢菌（放線菌模式菌株）中GlcNAc信號之間的直接聯系，并闡明蛋白質酰基化與c-di-GMP協同調控放線菌發育與抗生素合成機制的研究進展。
詳見：
項目文章 | Nature子刊：ChIP-seq等揭示c-di-AMP與DasR互作以調控細菌生長、發育和抗生素合成
項目文章 | NAR：ChIP-seq等揭示蛋白質酰基化與c-di-GMP協同調控放線菌發育與抗生素合成機制
本研究再次突破，通過ChIP-seq等分析揭示了AcP依賴的乙酰化修飾網絡對c-di-AMP穩態的調控機制，為理解放線菌的生長發育、抗生素合成以及環境適應機制提供了新視角，為開發新型抗菌藥物和優化抗生素生產菌株奠定理論基礎。
 
研究要點
c-di-AMP鑒定對于細菌生長和細胞生理是必需的，因此本研究的主要挑戰是細胞信號和刺激如何進入決定c-di-AMP濃度的決策過程，以及這些信息如何整合到調控通路中。研究以S. erythraea為模型驗證了AcP依賴的DisA乙酰化及其轉錄抑制因子DasR參與協調環境信號和細胞內信號，這對于c-di-AMP穩態至關重要。

具體而言，DisA的K66位點乙酰化直接失活其二腺苷酸環化酶活性，從而抑制c-di-AMP產生，而DasR的K78位點乙酰化則導致disA表達增加和c-di-AMP水平升高。因此，AcP是c-di-AMP維持中的一個關鍵分子開關，它響應環境變化，可能抑制有效發育。因此，AcP介導的翻譯后修飾（PTM）構成了合成酶/水解酶調控c-di-AMP穩態的網絡。
 
乙酰磷酸（AcP）調控c-di-AMP穩態通路示意圖
研究方法
蛋白質乙酰化狀態檢測：通過免疫沉淀（ImmunopreciPItation, IP）和免疫印跡（Immunoblotting, IB）分析檢測DisA和DasR的乙酰化水平。
體外乙酰化實驗：利用AcP對DisA和DasR進行體外乙酰化反應，驗證其乙酰化位點。
質譜分析（LC-MS/MS）：鑒定乙酰化修飾的位點，確定DisA的K66和DasR的K78為關鍵乙酰化位點。
酶活性檢測：通過酶活性實驗檢測乙酰化對DisA二腺苷酸環化酶（DAC）活性的影響。
基因轉錄分析：利用實時定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）檢測disA基因的轉錄水平。
染色質免疫沉淀測序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq）：分析DasR在基因組上的結合位點，驗證其對disA基因的轉錄調控。
生物物理實驗：圓二色光譜（Circular Dichroism, CD）分析、化學交聯實驗和生物層干涉（Biolayer Interferometry, BLI）實驗，研究乙酰化對蛋白結構和DNA結合能力的影響。
細胞生理實驗：通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同突變株的發育表型。
 
結果圖形
（1）AcP依賴的乙酰化直接抑制DisA的DAC活性
研究發現，在氮限制條件下，DisA乙酰化水平顯著升高，且AcP能夠直接乙酰化DisA。體外實驗表明，乙酰化DisA的DAC活性降低約75%，表明AcP依賴的乙酰化顯著抑制了DisA的酶活性。進一步的質譜分析鑒定出DisA的K66為關鍵乙酰化位點，位于其DAC結構域內，該位點乙酰化導致DisA八聚體結構解離，從而抑制其DAC活性，減少c-di-AMP合成。
 
圖1：AcP誘導的DisA乙酰化抑制其DAC活性。
  (A) 在氮充足（N⁺）或氮限制（N^-）條件下，S. erythraea野生型（WT）菌株的DisA乙酰化水平。
(B) 在37°C下，使用10 mM AcP對His標簽的DisA蛋白進行不同時間點（0、1、3和5h）的乙酰化處理。通過Western blotting使用特異性抗乙酰賴氨酸（anti-AcK）抗體檢測乙酰化水平。
(C) DisA野生型（DisA^WT）和乙酰化DisA（DisA^AcP）蛋白的DAC活性。
(D) DisA^WT和DisA^AcP蛋白的圓二色光譜（CD）圖。
(E) DisA的結構域組織以不同顏色的方框表示。
(F) DisA^WT、DisA^AcP、DisA^K66Q和DisA^K66R蛋白的交聯實驗。
(G) DisA^WT、DisA^K66Q和DisA^K66R蛋白的DAC活性。
 
（2）DisA主要在K66位點乙酰化時失活
通過構建DisA的K66突變體（K66Q和K66R），研究發現K66Q突變體的八聚體結構顯著減少，DAC活性亦顯著降低，而K66R突變體表現出與野生型相似活性。這表明K66位點乙酰化是DisA失活的主要原因。此外，過表達DisAK66Q的菌株中c-di-AMP水平顯著降低，進一步驗證K66乙酰化對c-di-AMP合成的抑制作用。
 
圖2：K66乙酰化對體內c-di-AMP合成的影響。
  (A)  S. erythraea野生型（WT）、過表達DisAWT（OdisA^WT）、過表達DisAK66Q（OdisA^K66Q）和過表達DisAK66R（OdisA^K66R）菌株在30°C下TSB培養基中培養的生長曲線。
(B) 在TSB培養基中培養的WT、OdisA^WT、OdisA^K66Q和OdisA^K66R菌株中disA基因的轉錄水平。
(C) 在TSB培養基中培養的WT、OdisA^WT、OdisA^K66Q和OdisA^K66R菌株的細胞提取物中細胞內的c-di-AMP水平。
 
（3）AcP依賴的乙酰化通過失活DasR消除對disA的轉錄調控
研究發現，DasR是disA基因的轉錄抑制因子，而AcP能夠乙酰化DasR并影響其功能。在氮限制條件下，DasR乙酰化水平顯著升高，且AcP能夠直接乙酰化DasR。乙酰化使DasR的DNA結合能力顯著減弱，從而消除對disA的轉錄抑制，導致c-di-AMP水平升高。 圖3：AcP誘導的DasR乙酰化阻斷其DNA結合活性。
  (A) 在氮充足（N⁺）或氮限制（N^-）條件下，S. erythraea WT菌株中DasR乙酰化水平。
(B) 在37°C下，使用10 mM AcP對His標簽的DasR蛋白不同時間點（0、1、3和5h）乙酰化處理。通過Western blotting使用特異性抗乙酰賴氨酸（anti-AcK）抗體檢測乙酰化水平。
(C) DasR野生型（DasR^WT）和乙酰化DasR（DasR^AcP）與目標基因disA啟動子的結合電泳遷移率變化分析（EMSA）。
(D) DasR野生型（DasR^WT）和乙酰化DasR（DasR^AcP）蛋白的圓二色光譜（CD）圖。
(E) DasR的結構域組織以不同顏色的方框表示。
(F) DasR及其突變體與目標基因disA啟動子的結合EMSA分析。
(G) 純化的His-DasR、DasR^AcP、DasR^K78Q和DasR^K78R與disA基因啟動子的結合BLI實驗。
(H) DasR及其突變體的交聯實驗。
 
（4）DasR的K78位點乙酰化促進disA轉錄和c-di-AMP合成
質譜分析鑒定出DasR的K78為關鍵乙酰化位點。通過構建DasR的K78突變體（K78Q和K78R），研究發現K78Q突變體的DNA結合能力顯著減弱，而K78R突變體則表現出與野生型相似的活性。ChIP-seq分析顯示，K78乙酰化顯著降低了DasR在disA啟動子區域的結合能力，從而消除對disA的轉錄抑制，促進c-di-AMP的合成。
  圖4：K78乙酰化在體內消除DasR介導的對disA的抑制作用。
  (A) ChIP-seq信號密度在peaks中心和轉錄起始位點（±2 kb）熱圖。顯示了平均信號強度。紅色表示信號強度低，藍色表示信號強度高。
(B) 指定菌株中的ChIP-seq信號。
(C) 在指定菌株中，disA啟動子區域的ChIP-seq信號的整合基因組瀏覽器（IGV）軌跡。
(D) 指定菌株中disA的轉錄水平。倍數變化表示與DasR野生型（DasR^WT）菌株相比的表達水平。
(E) 指定菌株中細胞內的c-di-AMP水平。
 
（5）c-di-AMP穩態介導多細胞分化
研究發現，c-di-AMP水平變化對S. erythraea菌發育和孢子形成具有顯著影響。過表達DisA^K66Q的菌株表現出延遲的孢子形成，而過表達DisA^K66R菌株則表現出過度孢子形成。這表明c-di-AMP水平升高促進了孢子形成，而K66位點乙酰化則抑制這一過程。此外，DasR的K78乙酰化也通過調控c-di-AMP水平影響孢子形成。
  圖5：AcP誘導的乙酰化影響孢子形成。
  S. erythraea野生型（WT）、過表達DisA^K66Q（OdisA^K66Q）、過表達DisA^K66R（OdisA^K66R）、過表達DasR^K78Q（OdasR^K78Q）和過表達DasR^K78R（OdasR^K78R）菌株在30°C下于R2YE agar上培養96小時后的掃描電子顯微照片。圖像放大倍數為×5000。兩次重復實驗中結果相似的代表性圖片。
 
（6）AcP與c-di-AMP穩態之間的生理聯系保守
通過序列比對分析，研究發現DisA的K66和DasR的K78位點在多種放線菌中高度保守。這表明AcP依賴的乙酰化調控c-di-AMP穩態的機制在放線菌中具有廣泛的保守性，可能對放線菌的生長發育和抗生素合成具有普遍的調控作用。
 
圖6：放線菌中DasR和DisA蛋白的序列比對。
  對以下物種的DisA（A）和DasR（B）蛋白序列進行了比對：青鏈霉菌（Streptomyces lividans）、天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）、阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）、灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）、委內瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）、紅孢鏈霉菌（Streptosporangium roseum）、熱單胞菌（Thermomonospora curvata）以及紅色糖多孢菌（S. erythraea）。所有物種中保守的賴氨酸殘基以紅色加粗顯示。
 
討論
本研究揭示了AcP依賴的乙酰化修飾網絡在調控c-di-AMP穩態中的重要作用。AcP通過乙酰化修飾DisA和DasR，直接或間接調控c-di-AMP的合成與降解。這種調控機制不僅在紅色糖多孢菌中存在，還在其他放線菌中具有廣泛的保守性。此外，c-di-AMP水平的變化對細菌的生長發育和抗生素合成具有顯著影響，表明c-di-AMP穩態調控對于放線菌的生理功能至關重要。未來的研究可以進一步探索AcP依賴的乙酰化修飾在其他細菌中的作用機制，以及如何通過調控c-di-AMP穩態來優化抗生素生產菌株。

ChIP-seq在本研究中的重要作用
本研究通過ChIP-seq分析，研究者精確地定位DasR在基因組上的結合位點，驗證了DasR對disA基因的直接轉錄調控。此外，ChIP-seq數據還揭示了AcP依賴的乙酰化如何通過影響DasR的DNA結合能力來調控c-di-AMP合成，為研究c-di-AMP穩態的分子機制提供重要依據。

參考文獻：
Fu Y, Zhao L-C, Shen J-L, Zhou S-Y, Yin B-C, Ye B-C, You D. A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria. mBio. 2024 Jul 9:e0141124. doi: 10.1128/mbio.01411-24.