該研究由Yusaku Hontani、Fei Xia和Chris Xu等人合作完成，發(fā)表于《Science Advances》，題為《Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brAIn》。研究團(tuán)隊(duì)來自康奈爾大學(xué)應(yīng)用與工程物理系及生物醫(yī)學(xué)工程系，長期致力于多光子顯微鏡技術(shù)的創(chuàng)新與應(yīng)用。

重要發(fā)現(xiàn)
01傳統(tǒng)多光子成像的技術(shù)瓶頸與突破方向
多光子熒光顯微鏡通過長波長光子的非線性激發(fā)實(shí)現(xiàn)深層成像，其中雙光子顯微鏡（2PM）和三光子顯微鏡（3PM）是主流技術(shù)。與2PM相比，3PM憑借更長的激發(fā)波長（如1300nm和1700nm）和更高的非線性限制，在深層組織（如小鼠腦海馬區(qū)）中具有更強(qiáng)的穿透能力和圖像對(duì)比度。

然而，傳統(tǒng)3PM的多色成像面臨核心挑戰(zhàn)：不同顏色熒光分子（如綠色和紅色）的激發(fā)光譜差異大，需依賴雙波長（如1300nm和1700nm）分別激發(fā)，導(dǎo)致光學(xué)系統(tǒng)復(fù)雜、總激發(fā)功率高，且信號(hào)強(qiáng)度因三階非線性效應(yīng)較弱而受限。

這一藍(lán)移激發(fā)機(jī)制帶來兩大突破：
（1）單波長兼容多色熒光：使用1340nm單一波長，即可同時(shí)激發(fā)綠色熒光分子（如GCaMP6s）至最低激發(fā)態(tài)（對(duì)應(yīng)1300nm光學(xué)窗口的傳統(tǒng)路徑），以及紅色熒光分子至更高激發(fā)態(tài)，實(shí)現(xiàn)綠色（525nm發(fā)射）、紅色（617nm發(fā)射）熒光的同步采集。

（2）信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)：在1300nm波段，部分紅色熒光分子（如Texas Red、SR 101）的三光子激發(fā)截面比傳統(tǒng)1700nm波段提升10倍以上。例如，Texas Red 在1340nm處的三光子截面達(dá)～11×10??2cm?(s/photons)2，而1700nm處僅為～0.56×10??2cm?(s/photons)2，信號(hào)強(qiáng)度提升約20倍。

PrismPlus轉(zhuǎn)基因小鼠在1340nm激發(fā)下熒光蛋白的多色3P熒光圖像

多色成像能力
利用1340nm單波長，成功同時(shí)成像GCaMP6s標(biāo)記的神經(jīng)元（綠色）、Texas Red標(biāo)記的血管（紅色）及三次諧波生成（THG，藍(lán)色），深度達(dá)1200μm；在PrismPlus轉(zhuǎn)基因小鼠中，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)Cerulean（青色）、EGFP（綠色）、YFP（黃色）、DsRed-Max（紅色）四色熒光的同步采集，驗(yàn)證了技術(shù)的普適性。

光穩(wěn)定性提升
對(duì)比SR101在1340nm和1700nm激發(fā)下的光漂白速率，前者的熒光衰減速度降低約50%，表明藍(lán)移激發(fā)可減少長期成像中的光損傷。

體內(nèi)小鼠大腦中Texas Red標(biāo)記血管的多光子圖像

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破多色成像的技術(shù)壁壘
傳統(tǒng)多光子成像中，多色熒光需依賴雙波長激光源、復(fù)雜光路切換及功率疊加，不僅增加實(shí)驗(yàn)成本，還可能因光毒性限制成像時(shí)長。本研究通過單波長激發(fā)兼容多色熒光分子，無需額外光學(xué)組件即可實(shí)現(xiàn)綠色、紅色甚至四色熒光的同步采集，簡化了系統(tǒng)復(fù)雜度，為實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測細(xì)胞間相互作用提供了可能。

總結(jié)與展望
多光子熒光顯微鏡技術(shù)的革新始終圍繞“更深、更亮、更精準(zhǔn)”的目標(biāo)。該研究通過藍(lán)移激發(fā)機(jī)制，將單波長多色成像與深層穿透能力結(jié)合，不僅解決了傳統(tǒng)3PM的技術(shù)瓶頸，更開辟了熒光分子激發(fā)的新維度——無需依賴新型熒光蛋白或復(fù)雜合成，即可通過現(xiàn)有分子的高階激發(fā)態(tài)實(shí)現(xiàn)性能躍升。未來該技術(shù)有望在以下方向拓展，結(jié)合光纖探針或微型化顯微鏡，實(shí)現(xiàn)自由活動(dòng)動(dòng)物的腦內(nèi)動(dòng)態(tài)多色成像，推動(dòng)神經(jīng)環(huán)路功能研究。與光遺傳學(xué)、電生理記錄等技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建“結(jié)構(gòu)-功能-調(diào)控”一體化的研究平臺(tái)?；谒{(lán)移激發(fā)原理，系統(tǒng)性篩選具有高激發(fā)截面的熒光分子，進(jìn)一步優(yōu)化成像信噪比。

從實(shí)驗(yàn)室到應(yīng)用，單波長三光子顯微鏡正以其創(chuàng)新性和實(shí)用性，為探索生命奧秘打開一扇更明亮的“光學(xué)窗口”。隨著技術(shù)的普及，我們有望在不久的將來，更清晰地解碼大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)圖譜，乃至實(shí)時(shí)觀測腫瘤微環(huán)境、器官發(fā)育等復(fù)雜生物學(xué)過程。

DOI:10.1126/sciadv.abf3531.