非洲豬瘟P54抗體制備方法及核心參數_abio生物試劑品牌網
非洲豬瘟（African Swine Fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的豬烈性傳染病，P54 蛋白是 ASFV 的重要結構蛋白（由病毒 B646L 基因編碼），具有高度保守性和免疫原性，是診斷試劑研發的關鍵靶標。針對 P54 蛋白的單克隆抗體（P54 mAb）因特異性強、穩定性高，被廣泛用于 ASF 的快速檢測與診斷。以下從制備方法及核心參數（特異性、交叉率、檢出限、靈敏度等）展開說明：
一、非洲豬瘟 P54 單克隆抗體的制備流程 P54 單克隆抗體的制備基于雜交瘤技術，核心步驟包括抗原制備、免疫小鼠、細胞融合及抗體篩選，具體流程如下：
二、P54 單克隆抗體的核心參數及意義
1. 特異性（Specificity）
三、參數優化與應用場景 P54 單克隆抗體的參數需根據應用場景調整：
一、非洲豬瘟 P54 單克隆抗體的制備流程 P54 單克隆抗體的制備基于雜交瘤技術，核心步驟包括抗原制備、免疫小鼠、細胞融合及抗體篩選，具體流程如下：
- 抗原制備
- 以 ASFV P54 蛋白為抗原：可通過原核表達（如大腸桿菌表達重組 P54 蛋白）或真核表達（如昆蟲細胞表達帶修飾的 P54 蛋白，更接近天然構象）獲得高純度抗原，純度需達 90% 以上，避免雜蛋白干擾免疫效果。
- 小鼠免疫
- 選擇 6-8 周齡 BALB/c 小鼠，采用 “基礎免疫 + 加強免疫” 方案：首次免疫用弗氏完全佐劑乳化抗原（劑量 50-100μg / 只），皮下或腹腔注射；2-3 周后用弗氏不完全佐劑加強免疫 2-3 次，最后一次免疫后 3-5 天取血清檢測抗體效價（效價≥1:10000 可進行下一步）。
- 細胞融合與篩選
- 取免疫小鼠的脾臟 B 淋巴細胞，與骨髓瘤細胞（如 SP2/0）在 PEG（聚乙二醇）作用下融合，形成雜交瘤細胞；
- 通過 HAT 培養基篩選雜交瘤細胞（排除未融合的 B 細胞和骨髓瘤細胞），再用間接 ELISA 法篩選能分泌抗 P54 抗體的陽性克隆。
- 克隆化與抗體生產
- 對陽性雜交瘤細胞采用有限稀釋法或流式細胞術克隆化，確保單克隆性；
- 克隆穩定后，可通過小鼠腹腔接種生產腹水型抗體，或通過無血清培養基體外培養生產培養液型抗體，經 Protein G/A 親和層析純化，純度可達 95% 以上。
二、P54 單克隆抗體的核心參數及意義
1. 特異性（Specificity）
- 定義：指抗體僅與 ASFV P54 蛋白結合，而不與其他無關蛋白或病原體蛋白交叉反應的能力。
- 檢測方法：
- 采用 Western blot 檢測抗體與重組 P54 蛋白的結合（應出現單一特異性條帶，分子量約 54 kDa）；
- 檢測與其他豬病毒（如豬瘟病毒 CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 PRRSV、偽狂犬病病毒 PRV）的結構蛋白是否交叉反應；
- 檢測與健康豬組織蛋白（如肝、脾、腎勻漿）的交叉反應。
- 理想標準：僅特異性識別 ASFV P54 蛋白，與其他病毒及豬自身蛋白無交叉反應，確保診斷特異性。
- 定義：指抗體與非目標抗原（如其他 ASFV 毒株的 P54 蛋白、近緣病毒蛋白）發生交叉反應的概率，通常以百分比表示。
- 檢測對象：
- 不同 ASFV 基因型毒株（全球已發現 24 種基因型）的 P54 蛋白（因 P54 高度保守，交叉率應接近 100%，確保對各毒株均有反應）；
- 其他非洲豬瘟相關病毒（如無，因 ASFV 為唯一成員）或干擾病毒（如上述 CSFV、PRV 等，交叉率應≤1%）。
- 關鍵意義：對 ASFV 不同毒株的高交叉率可保證檢測覆蓋范圍，對其他病毒的低交叉率可避免假陽性。
- 定義：指抗體可檢測到的 P54 蛋白最低濃度（或 ASFV 病毒最低滴度），是衡量檢測靈敏度的核心指標。
- 檢測方法：
- 用梯度稀釋的重組 P54 蛋白（如 100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL…）通過 ELISA 檢測，以信號值為閾值 2.1 倍時的濃度為 LOD；
- 用梯度稀釋的 ASFV 病毒液（如 10? TCID??/mL、10? TCID??/mL…）通過免疫熒光或膠體金法檢測，確定可識別的最低病毒滴度。
- 典型范圍：優質 P54 單克隆抗體的 ELISA 檢出限通常可達0.1-1 ng/mL（重組蛋白）或102-103 TCID??/mL（病毒液），滿足早期感染檢測需求。
- 定義：指抗體在低濃度抗原存在時仍能產生可識別信號的能力，與檢出限直接相關（檢出限越低，靈敏度越高）。
- 實際應用意義：在 ASF 早期感染（病毒載量低）或亞臨床感染階段，高靈敏度抗體可避免漏檢。例如，發病前 2-3 天的豬血液中病毒含量較低，高靈敏度抗體可通過 ELISA 或膠體金試紙條檢出，為疫情防控爭取時間。
- 評價方式：通過系列稀釋的陽性樣本（病毒液或 P54 蛋白）檢測，計算陽性檢出率（如 LOD 時的檢出率應≥95%）。
- 親和力（Affinity）：指抗體與 P54 抗原的結合強度，通常以平衡解離常數（Kd）表示，優質抗體 Kd 應≤10?? M（數值越小，親和力越強），可提高檢測反應速度和穩定性。
- 效價（Titer）：指抗體能與抗原發生可檢測反應的最高稀釋倍數（如腹水抗體效價通常≥1:10?，培養液抗體效價≥1:10?），反映抗體濃度和活性。
- 穩定性：包括熱穩定性（37℃放置 7 天或 4℃放置 6 個月，效價下降≤20%）和批次間一致性（不同批次抗體的檢出限、特異性差異≤10%），確保產業化應用的可靠性。
三、參數優化與應用場景 P54 單克隆抗體的參數需根據應用場景調整：
- 膠體金試紙條：需高靈敏度（LOD≤103 TCID??/mL）、快速反應（親和力高），適合現場快速篩查；
- ELISA 試劑盒：需高特異性（交叉率低）、寬線性范圍（1-1000 ng/mL），適合實驗室定量檢測；
- 病毒分離鑒定：需對各基因型毒株高交叉率，確保不遺漏變異毒株。
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