使用TR-FRET結合分析研究分子內雙價分子膠_abio生物試劑品牌網
靶向蛋白質降解（TPD）是通過誘導E3泛素連接酶和靶向蛋白質的接近來完成的，以促進靶向泛素化和隨后的蛋白酶體降解。TPD是一種新興的治療工具，在處理致病蛋白方面具有巨大潛力。過去，TPD是通過兩種方式實現的：一是使用蛋白質降解-靶向嵌合體（PROTACs），即由兩個獨立部分組成的雙功能化合物，分別與靶點和E3連接酶結合；二是使用單價結合連接酶或靶點的分子膠。
在今天的文章中，我們重點介紹一種名為分子內雙價粘合劑（Intramolecular Bivalent Glues, IBGs）的新型BRD4雙功能降解劑的作用機制，它為靶向蛋白質降解引入了新的模式。不同于PROTACs以trans構象連接目標蛋白和E3連接酶，IBGs以cis構象同時作用并連接目標蛋白的兩個相鄰結構域，從而增強與E3連接酶的表面互補性。這種構象變化利用目標蛋白與連接酶的天然親和力，將BRD4“粘”在E3連接酶DCAF16上，從而降解BRD4，而如果沒有這種化合物，則不會發生這種降解。通過對BRD4–IBG1–DCAF16三元復合物的結構解析，進一步指導了更高效降解劑的理性設計，使其效力達到低皮摩爾級別。
使用TR-FRET分析三元復合物形成
通過時間分辨熒光共振能量轉移（TR-FRET）形成分析法評估BRD4和DCAF16的三元復合物形成。該分析法使用針對BRD4的銪標記抗體和Cy5標記的DCAF16。如果IBG分子誘導標記的BRD4和DCAF16分子之間形成三元復合物，則熒光團之間的距離足夠近，可以形成熒光共振能量轉移（FRET）對。因此，激發銪供體熒光團將導致能量轉移，而Cy5受體熒光可以用酶標儀測量。
圖1：TR-FRET分子膠結合分析原理示意圖。
在TR-FRET分析中，Cy5標記的DCAF16、His-BRD4和抗His銪標記供體的儲備溶液均配制于TR-FRET緩沖液中（50 mM HEPES，pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM TCEP，0.05% Tween-20）。開展了兩類TR-FRET實驗：（1）將IBGs梯度滴定加入BRD4與Cy5-DCAF16混合物（復合物形成分析）；（2）將Cy5-DCAF16滴定加入BRD4或BRD4+IBG中（復合物穩定性分析）。
在前者實驗中，IBGs以1:4比例梯度稀釋，加入至100 nM BRD4與100 nM Cy5-DCAF16混合液中，裝入白色384孔板中，每孔體積為16 μL。在復合物穩定性實驗中，Cy5-DCAF16同樣以1:4比例稀釋加入。最終BRD4構建體濃度為200 nM，IBG1濃度為1 μM。無論哪種實驗格式，銪標記抗His抗體和DMSO濃度分別保持恒定在2 nM和0.5%。反應板以50g離心1分鐘后覆蓋靜置于室溫30分鐘，隨后使用PHERAstar FS讀板儀讀取結果。
雙價分子膠的特性與評估
本研究的首要目標是體外表征DCAF16、BRD4與雙價分子膠IBG1之間可能的相互作用。通過等溫滴定量熱法（ITC，數據未展示），觀察到IBG1、DCAF16與BRD4Tandem（包含BD1和BD2兩個溴結構域并由天然連接肽連接）形成三元復合物。同樣，TR-FRET復合物形成分析表明，在IBG1滴定條件下，BRD4Tandem與DCAF16之間以劑量依賴的方式形成三元復合物（EC50 = 44 nM；見圖2a）。總體來看，IBG1的活性強于其單價前體JQ1。
補充的TR-FRET穩定性分析進一步證實，在IBG1存在時，滴定DCAF16至BRD4Tandem時存在復合物形成（Kd = 712 nM；見圖2b）。令人意外的是，即使在不添加IBG1的情況下，也檢測到DCAF16與BRD4Tandem存在內在親和力（Kd = 1 μM），但這種親和力在孤立的BRD4BD1或BD4BD2結構域中未觀察到，說明兩者需協同作用才能形成復合物。
通過ITC對比分析表明，在IBG1存在下，DCAF16與BRD4Tandem之間的親和力增強（Kd由4 μM降低至0.6 μM），同時相互作用的熱力學特性也發生改變。
圖2：A）TR-FRET三元復合物形成分析：Eu標記抗His抗體與BRD4Tandem結合后，加入等摩爾Cy5-DCAF16及不同濃度的IBG1或JQ1。結果以n=3次重復的平均±標準差表示。B）TR-FRET復合物穩定性分析：His標記的BRD4Tandem或BRD4BD1（200 nM）與Eu抗His抗體結合后，加入不同濃度的Cy5-DCAF16，并比較1 μM IBG1存在與否的效果。n=2次獨立實驗，技術重復2次。
進一步優化的IBG化合物
在確認IBG1的作用機制后，研究人員合成了新的化合物，以增強其對BRD4和DCAF16的分子膠合活性。新化合物IBG3在降解BRD4方面優于IBG1，其降解效率達到低皮摩爾水平（DC50 = 6.7 pM，數據未公開）。TR-FRET實驗中，IBG3對BRD4–DCAF16復合體的“粘合”能力也有所提升（EC50 = 32 nM；見圖3）。
圖3：TR-FRET三元復合物形成測定。將抗組蛋白結合到BRD4Tandem的抗組蛋白與等摩爾Cy5標記的DCAF16以及濃度不斷增加的IBG1、IBG3或JQ1混合。平均值±標準差，n=3。
與其前體化合物類似，IBG3相較于BRD3顯示出對BRD2和BRD4更高的特異性，更傾向于作用于串聯溴結構域而非孤立結構域，并且其機制仍由DCAF16介導，表明其仍通過同樣的分子內“膠合作用”實現降解。
結論
通過本文所描述的TR-FRET相互作用分析方法，可表征BRD4-DCAF16之間的新型分子膠。該類新型分子內雙價膠通過同時結合目標蛋白的兩個結構域，增強其與E3連接酶的親和力，形成新的相互作用模式。這一策略為靶向多種效應蛋白、重構細胞信號通路、實現蛋白降解及其他用途提供了前景廣闊的藥理學路徑。
圖4：PHERAstar FSX酶標儀。
轉載自：BMG LABTECH
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