細(xì)胞凍存是保存細(xì)胞的重要手段，通過(guò)低溫來(lái)延緩細(xì)胞的生命活動(dòng)。這種技術(shù)使細(xì)胞能夠得以保存，在需要的時(shí)候，又可以被復(fù)蘇用于各種實(shí)驗(yàn)。

19世紀(jì)末，科學(xué)家開始研究低溫對(duì)生物組織的影響。早期的實(shí)驗(yàn)表明，單純冷凍會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞冰晶形成和滲透壓失衡而死亡。1937年，Luyet和Hodapp提出“冰晶損傷”理論，為后續(xù)冷凍保護(hù)研究奠定了基礎(chǔ)。1949年，英國(guó)科學(xué)家在研究精子冷凍時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)甘油能顯著提高冷凍后精子的存活率。甘油是一種滲透性冷凍保護(hù)劑（CPA），可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，降低冰點(diǎn)并減少冰晶形成。它通過(guò)平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，防止細(xì)胞在冷凍過(guò)程中因脫水而破裂。1959年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜（DMSO）同樣具有優(yōu)異的冷凍保護(hù)效果，尤其適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。DMSO比甘油更易穿透細(xì)胞膜，且毒性較低，迅速成為細(xì)胞凍存的標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)劑之一。1963年P(guān)eter Mazur提出冷凍損傷的“兩因素假說(shuō)”：快速冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器；慢速冷凍時(shí)，細(xì)胞外冰晶形成導(dǎo)致細(xì)胞脫水，胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，造成化學(xué)毒性。該理論為程序化慢凍法提供了科學(xué)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大多數(shù)細(xì)胞的凍存遵循“慢速凍存”的原則，通過(guò)程序降溫盒或程序化冷凍儀，控制降溫速率（通常為1°C/min），使細(xì)胞在冷凍過(guò)程中逐步脫水，避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。該方法顯著提高了凍存細(xì)胞的存活率。

研究表明5%-10%的DMSO最適合細(xì)胞凍存，具體比例要根據(jù)細(xì)胞種類調(diào)整，對(duì)DMSO敏感的細(xì)胞則需要降低比例。根據(jù)小尚的經(jīng)驗(yàn)，8% DMSO適用于大部分細(xì)胞系。同時(shí)，還需根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)難度調(diào)整血清比例，越難養(yǎng)的細(xì)胞越要多加血清，過(guò)于脆弱的細(xì)胞可用血清+DMSO凍存，不加培養(yǎng)基。我們常用的凍存液配方是92%FBS+8%DMSO(新手推薦)或92%完全培養(yǎng)基+8%DMSO(高手推薦)。

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無(wú)論用何種凍存液，都建議做凍檢再正式凍存：即凍存24h后復(fù)蘇一支，確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)沒問(wèn)題，即可進(jìn)行大批量?jī)龃?。凍檢成功前要留至少一瓶細(xì)胞培養(yǎng)，以免復(fù)蘇失敗導(dǎo)致細(xì)胞絕種。

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