植物由于不能移動(dòng)，會(huì)受諸如風(fēng)、雪和動(dòng)物等逆境脅迫，這些脅迫可能會(huì)破壞植物結(jié)構(gòu)，因此再生能力對(duì)于植物生存至關(guān)重要。近日，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院李云教授團(tuán)隊(duì)探索了植物刺槐（Robinia pseudoacacia L.）的不定根（Adventitious Roots, ARs）再生過(guò)程中DNA低甲基化（Hypomethylation）對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用。研究通過(guò)使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷（5-azacytidine, 5-azaC）處理刺槐下胚軸切段，通過(guò)全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)，揭示了低甲基化激活以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而顯著增強(qiáng)不定根再生能力。相關(guān)研究成果以《DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots》為題發(fā)表于《Plant Cell Environ》期刊。  
標(biāo)題：DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots（DNA低甲基化激活以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，以增強(qiáng)不定根再生）
發(fā)表時(shí)間：2025年2月
發(fā)表期刊：Plant Cell Environ
影響因子：IF6.3/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq
作者單位：北京林業(yè)大學(xué)李云等
DOI：10.1111/pce.15236
 
本研究利用5-azaC DNA甲基化抑制劑，使根原基的啟動(dòng)和發(fā)育更早發(fā)生，從而提高刺槐的不定根再生率。WGBS揭示了在5-azaC處理樣本中，整體甲基化水平下降，而在所有背景（包括CHH、CHG和mergedCG）中，低甲基化胞嘧啶位點(diǎn)和區(qū)域增加，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄變異。酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）實(shí)驗(yàn)揭示了一個(gè)以RpMYB2為中心的轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factors, TFs）網(wǎng)絡(luò)，這些轉(zhuǎn)錄因子被RpWRKY23、RpGATA23、RpSPL16以及其他基因如RpSDP、RpSS1、RpBEN1、RpGULL05和RpCUV轉(zhuǎn)錄激活，其核定位表明它們可能共定位。酵母單雜交（Yeast One-Hybrid, Y1H）實(shí)驗(yàn)揭示RpMYB2互作蛋白R(shí)pGATA23、RpWRKY23與RpSK6、RpCDC48的啟動(dòng)子互作，而熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（Luciferase Reporting Assay, LRA）驗(yàn)證了其與RpSK6結(jié)合。本研究結(jié)果表明，低甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組修飾激活了以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，從而增強(qiáng)了刺槐下胚軸切段的不定根再生能力。這些發(fā)現(xiàn)為通過(guò)遺傳改良提高植物再生能力和增加木材產(chǎn)量，同時(shí)抵御環(huán)境損害提供了理論基礎(chǔ)。

研究方法

• 植物材料收集與再生：使用刺槐種子萌發(fā)后的下胚軸切段作為實(shí)驗(yàn)材料，分別在含和不含5-azaC的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察不定根再生情況。
• 石蠟切片與解剖分析：對(duì)處理和未處理的切段進(jìn)行石蠟切片，觀察不定根原基的啟動(dòng)和發(fā)育過(guò)程。
• WGBS分析：分析全基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平。
• RNA-seq分析：分析基因表達(dá)差異。
• 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證：對(duì)RNA-seq結(jié)果中差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。
• 酵母雙雜交（Y2H）和酵母單雜交（Y1H）實(shí)驗(yàn)：鑒定與RpMYB2互作蛋白，以及這些蛋白與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況。
• 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（LRA）：驗(yàn)證特定轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因啟動(dòng)子的結(jié)合。
• 亞細(xì)胞定位分析：通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞中的定位。

 
結(jié)果圖形
（1）不定根原基的啟動(dòng)與發(fā)育
研究通過(guò)石蠟切片觀察了5-azaC處理和未處理切段的不定根原基啟動(dòng)和發(fā)育過(guò)程。從8日齡幼苗的下胚軸切取1cm長(zhǎng)的切段作為外植體，并在切割后的五個(gè)時(shí)間點(diǎn)（包括切割后的第0天、第1天、第2天、第3天和第4天，分別標(biāo)記為D0、D1、D2、D3和D4）進(jìn)行橫截面分析。通過(guò)在不同時(shí)間點(diǎn)的組織學(xué)對(duì)比區(qū)分對(duì)照組（D1C、D2C、D3C、D4C）和5-azaC處理組（D1T、D2T、D3T、D4T）外植體中原基的發(fā)育進(jìn)程以及根分生組織的增殖情況。結(jié)果顯示，5-azaC處理顯著加速了不定根原基的啟動(dòng)和發(fā)育，處理組在第4天即可觀察到不定根的形成，而對(duì)照組則未能發(fā)育出完整的不定根（圖1）。這表明5-azaC通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，顯著增強(qiáng)了不定根的再生能力。
  圖1：不定根形成及橫切切段的解剖學(xué)研究。
  (a) 1cm長(zhǎng)的下胚軸切段放置在含和不含5-azaC培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征。
(b) 每段不定根數(shù)量。
(c) 下胚軸切段的解剖結(jié)構(gòu)顯示了不定根原基的啟動(dòng)和發(fā)育。與對(duì)照組相比，處理組（D2T）的不定根原基啟動(dòng)更早。在（D3T）中形成了根冠，而在（D4T）中原基發(fā)展為功能性不定根，但在（D3C，D4C）中，根分生組織未能發(fā)育。
 
（2）全基因組甲基化圖譜與不定根再生能力
通過(guò)WGBS分析，研究發(fā)現(xiàn)5-azaC處理顯著降低了基因組整體甲基化水平，尤其是在CHH、CHG和mergedCG三種序列背景下。在基因組的不同區(qū)域（包括啟動(dòng)子、基因體和終止子下游區(qū)域），處理組的甲基化水平均顯著低于對(duì)照組，尤其是在CHH背景下，甲基化水平降低更為顯著（圖2a-c）。這表明低甲基化可能通過(guò)影響基因表達(dá)調(diào)控來(lái)增強(qiáng)不定根的再生能力。
  圖2：5-azaC處理介導(dǎo)全基因組低甲基化。
  在5-azaC處理和對(duì)照樣本中，第2天和第4天的基因及其±2kb區(qū)域CHH背景（a）、CHG背景（b）和mergedCG背景（c）中的DNA甲基化水平變化。在CHH背景（d）、CGH背景（e）和mergedCG背景（f）中，不同基因組元件（包括啟動(dòng)子、外顯子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差異甲基化位點(diǎn)（DMCs）數(shù)量。在CHH背景（g）、CGH背景（h）和mergedCG背景（i）中，不同基因組元件（包括啟動(dòng)子、外顯子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差異甲基化區(qū)域（DMRs）數(shù)量。
 
（3）低甲基化位點(diǎn)和區(qū)域激活與不定根再生相關(guān)的基因
研究通過(guò)分析差異甲基化位點(diǎn)（DMCs）和差異甲基化區(qū)域（DMRs），發(fā)現(xiàn)5-azaC處理顯著增加了基因調(diào)控區(qū)域的低甲基化位點(diǎn)和區(qū)域數(shù)量。特別是在啟動(dòng)子區(qū)域，低甲基化的DMCs和DMRs數(shù)量顯著多于高甲基化的情況（圖2d-i）。這些低甲基化位點(diǎn)和區(qū)域與不定根再生相關(guān)的基因表達(dá)激活密切相關(guān)，如RpMYB2、RpWRKY23等基因在低甲基化后表達(dá)顯著上調(diào)。
 
（4）轉(zhuǎn)錄組分析鑒定5-azaC處理激活的基因及低甲基化RpMYB2的潛在互作因子
RNA-seq分析顯示，5-azaC處理顯著改變了基因表達(dá)譜，特別是在處理4天后，差異表達(dá)基因數(shù)量顯著增加。這些差異表達(dá)基因主要包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程（圖3）。其中，低甲基化激活的基因如RpMYB2、RpWRKY23等在不定根再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且這些基因可能通過(guò)與其他基因互作來(lái)調(diào)控不定根再生。
  圖3：DNA低甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組變化，從而引起基因差異表達(dá)。
  火山圖展示了D2C與D2T組（a）以及D4C與D4T組（b）之間的差異表達(dá)基因（DEGs）。熱圖描繪了D2C與D2T組（c）以及D4C與D4T組（d）之間的差異表達(dá)基因。所選上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)量（e）。
 
（5）酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)揭示低甲基化RpMYB2在增強(qiáng)生根能力的基因互作網(wǎng)絡(luò)中的中心地位
酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低甲基化激活的RpMYB2是基因互作網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，與多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和功能蛋白相互作用，如RpGATA23、RpWRKY23、RpSDP等（圖4）。這些相互作用蛋白在不定根再生過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用，調(diào)控細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程。
 
圖4：通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白-蛋白互作。展示RpMYB2和RpSDP蛋白與其他蛋白的正向互作。  
（6）酵母單雜交實(shí)驗(yàn)揭示以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)一步見解）
酵母單雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了RpMYB2互作蛋白與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RpWRKY23和RpGATA23能夠與RpSK6和RpCDC48的啟動(dòng)子結(jié)合，表明這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控下游基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)不定根的再生能力（圖5A）。
  圖5：通過(guò)酵母單雜交和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析DNA-蛋白互作。

1. 酵母單雜交（Y1H）展示了不同轉(zhuǎn)錄因子與RpSK6和RpCDC48啟動(dòng)子之間的相互作用。
2. 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示轉(zhuǎn)錄因子RpWRKY23和RpGATA23與RpSK6啟動(dòng)子的相互作用。

 （7）熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證RpWRKY23和RpGATA23蛋白與RpSK6啟動(dòng)子的互作
熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了酵母單雜交實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，即RpWRKY23和RpGATA23能夠與RpSK6的啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá)（圖5B）。這表明這些轉(zhuǎn)錄因子在不定根再生過(guò)程中通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)發(fā)揮重要作用。
 
（8）亞細(xì)胞定位分析揭示以RpMYB2為中心的互作網(wǎng)絡(luò)中蛋白的亞細(xì)胞定位
亞細(xì)胞定位分析顯示，RpMYB2及其互作蛋白主要定位于細(xì)胞核，部分蛋白如RpSDP和RpWRKY23還定位于細(xì)胞質(zhì)膜（圖6）。這表明這些蛋白在細(xì)胞核內(nèi)與其他基因相互作用，調(diào)控基因表達(dá)，同時(shí)也可能參與細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。
 
圖6：RpMYB2互作蛋白的亞細(xì)胞定位。共聚焦激光掃描顯微鏡圖像顯示了用GFP標(biāo)記的蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布。所有研究的蛋白主要定位于細(xì)胞核。RpMYB2、RpSDP和RpWRKY23還顯示出在質(zhì)膜定位。
結(jié)論和啟示
本研究通過(guò)WGBS和RNA-seq技術(shù)揭示了DNA低甲基化在刺槐不定根再生中的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，5-azaC處理通過(guò)降低基因組整體甲基化水平，激活了以RpMYB2為中心的基因網(wǎng)絡(luò)，顯著增強(qiáng)了不定根的再生能力。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解植物再生的分子機(jī)制提供了新的視角，還為通過(guò)遺傳改良提高植物再生能力和適應(yīng)環(huán)境脅迫提供了潛在的靶點(diǎn)。

WGBS和RNA-seq技術(shù)在解析植物表觀遺傳調(diào)控中的重要作用
WGBS和RNA-Seq的聯(lián)合應(yīng)用，研究者能夠從表觀遺傳修飾和基因表達(dá)兩個(gè)層面，全面解析DNA低甲基化在不定根再生中的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)整合分析，研究者發(fā)現(xiàn)低甲基化位點(diǎn)和區(qū)域的變化直接導(dǎo)致了相關(guān)基因表達(dá)的激活，從而促進(jìn)了不定根的再生。這種協(xié)同分析不僅揭示了DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用，還為理解植物再生過(guò)程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。

關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）
全基因組重亞硫酸鹽甲基化測(cè)序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測(cè)所有單個(gè)胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時(shí)空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應(yīng)用在個(gè)體發(fā)育、衰老和疾病等生命過(guò)程的機(jī)制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。

易基因全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)通過(guò)T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過(guò)重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進(jìn)而通過(guò)接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。

應(yīng)用方向：
WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯(cuò)過(guò)關(guān)鍵位點(diǎn)）

• 全基因組甲基化圖譜課題
• 標(biāo)志物篩選課題
• 小規(guī)模研究課題

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 應(yīng)用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；
• 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；
• 單堿基分辨率：可精確分析每一個(gè)C堿基的甲基化狀態(tài)。

參考文獻(xiàn)：
HussAIn SS, Li Y, Liu J, Abbas M, Li Q, Deng H, Abbas S, Han K, Han J, Sun Y, Li Y. DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots. Plant Cell Environ. 2024 Oct 28. doi: 10.1111/pce.15236.