該研究由Falko Fuhrmann、Felix C. Nebeling、Fabrizio Musacchio等學者共同完成，文章題為《Three-photon in vivo imaging of neurons and glia in the medial prefrontal cortex with sub-cellular resolution》，于2025年5月在線發表于《Communications Biology》。

重要發現
01三光子成像技術的搭建與優化
為了實現對mPFC的深層活體成像，研究團隊搭建了一套先進的三光子顯微鏡系統。該系統采用了可調諧激光（1300-1700nm），激光重復頻率穩定在2MHz，并配備了900-1900nm鍍膜光學元件，確保長波長激發光的有效傳輸。

關鍵的技術優化包括：
色散補償，通過棱鏡補償器減少飛秒激光在光路中的脈沖展寬，提升熒光激發效率，使1mm深度處的高亮度熒光信號更豐富，信噪比顯著提高；

物鏡選擇，對比多款物鏡后，選用了Olympus25x水浸物鏡（數值孔徑1.05，傳輸波長至1700nm），其在1mm深度的熒光強度和信噪比表現最優；

擴大探測光學元件尺寸，增加非彈道光子的收集角度（從8°增至14°），進一步提升信號質量。這些優化讓系統能穿透小鼠顱骨窗口，清晰成像mPFC的各個區域和層級。

對于星形膠質細胞，團隊通過表達GCaMP5g的小鼠模型，在1200μm深度觀察到其鈣活動，包括離散微域的自發鈣事件和胞體的鈣變化，且這些活動的振幅、持續時間和頻率與淺層星形膠質細胞相似，表明深層星形膠質細胞的基礎功能特性具有一致性。

在小膠質細胞研究中，使用1650nm波長激發紅色熒光標記的小膠質細胞，首次在1100μm深度量化其突起的運動性，發現其周轉率為58.9±2%，且連續兩天成像顯示運動特性穩定，證明該技術的低侵入性。

此外，研究還實現了樹突棘密度的長期追蹤：在1mm以下深度，連續一周記錄到樹突棘密度為0.41±0.07μm?1，為研究神經元結構可塑性提供了新工具。

創新與亮點
01突破傳統成像的深度瓶頸
傳統雙光子成像受限于光散射，在腦組織中的成像深度通常不足1mm，且難以實現亞細胞分辨率。而本研究的三光子成像技術通過采用1300-1700nm的長波長激光，顯著減少了光在深層組織中的散射和吸收，將成像深度提升至1700μm，是雙光子成像的1.5倍以上。這一突破讓科研人員得以探索mPFC等以往難以觸及的深層腦區，為理解全腦網絡連接打開了新窗口。

總結與展望
本研究成功開發并應用三光子活體成像技術，在小鼠mPFC實現了1700μm深度的亞細胞分辨率成像，首次同時記錄了神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞的結構與功能特性，突破了傳統成像技術的深度和侵入性限制。

展望未來，該技術將成為探索mPFC在認知功能（如工作記憶、情緒調控）中作用的核心工具，助力揭示阿爾茨海默病、精神分裂癥等疾病的發病機制。同時，其在深層組織成像中的優勢也有望擴展到其他器官研究，推動整個生物醫學成像領域的發展，為精準醫學和神經科學研究帶來革命性突破。

DOI:10.1038/s42003-025-08079-8.