三代ONT測序技術(shù)檢測組織DNA甲基化R10和R9芯片測序性能數(shù)據(jù)比較_abio生物試劑品牌網(wǎng)
近日，美國波士頓東北大學(xué)Miten JAIn團隊評估了牛津納米孔測序（Oxford Nanopore Technologies, ONT）技術(shù)在檢測人類原代組織DNA甲基化中的性能，特別比較了 ONT R9和升級版R10測序芯片在檢測人體外細胞系、腦組織和血液樣本的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）數(shù)據(jù)差異，并與其他測序技術(shù)（PacBio長讀長測序和Illumina亞硫酸鹽測序）進行多層次比較分析。研究結(jié)果表明，ONT R10芯片檢測DNA甲基化具有更高的準(zhǔn)確性和分辨率，尤其是在同聚物區(qū)域（homopolymer regions）。
doi: 10.1101/gr.279159.124
近年來，ONT和PacBio單分子測序技術(shù)促進了長讀長天然DNA分子（包括胞嘧啶甲基化）測序的發(fā)展。特別是ONT最近將其納米孔測序芯片從R9版本升級到R10版本，極大提高了測序的準(zhǔn)確性和通量水平。但這種升級對甲基化檢測的作用尚未被報道。本研究比較了ONT納米孔測序R9和R10芯片對三種人類基因組數(shù)據(jù)集（體外細胞系樣本、大腦前額葉皮層樣本和血液樣本）的5mC檢測結(jié)果差異。研究者對CpG島和同聚物區(qū)域進行深入分析，并比較不同測序技術(shù)之間甲基化檢測數(shù)據(jù)的一致性，分析結(jié)果表明在體外細胞系數(shù)據(jù)集中，ONTR10芯片與Illumina亞硫酸鹽測序技術(shù)之間的相關(guān)性最強。
易小結(jié)
本研究通過對比ONT納米孔測序技術(shù)的R9和R10芯片，揭示了ONT R10芯片在檢測人類原代組織DNA甲基化中的顯著優(yōu)勢，特別是在提高測序準(zhǔn)確性和檢測極值甲基化水平（0%和100%）方面表現(xiàn)優(yōu)異，為表觀遺傳學(xué)研究提供了更精準(zhǔn)工具。
ONT長讀長測序能夠直接檢測DNA序列及其修飾，無需額外樣本處理，極大簡化了表觀遺傳學(xué)研究流程。研究不僅驗證了ONT R10在甲基化檢測中的高效性和準(zhǔn)確性，還為未來大規(guī)模基因組測序項目（如隊列研究）提供了重要的技術(shù)參考。
易基因作為專注于表觀基因組技術(shù)的公司，其相關(guān)業(yè)務(wù)產(chǎn)品如ONT R10長讀長測序、全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）等，可為客戶提供更全面、更精準(zhǔn)的表觀遺傳學(xué)解決方案，助力在基因調(diào)控、疾病機制和藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域取得突破性進展。
研究方法
樣本收集與測序：人血液、大腦和體外細胞系樣本。
數(shù)據(jù)處理與分析：R9樣本使用Guppy v6.1.2進行堿基識別，R10樣本使用Guppy v6.3.8進行堿基識別。使用minimap2將reads比對至GRCh38人類參考基因組，并使用Modkit工具從比對后的BAM文件中提取甲基化信息。此外還使用DeepVariant和Sniffles2進行變異檢測。
甲基化檢測與比較：通過比較R9和R10測序數(shù)據(jù)在CpG島、同聚物區(qū)域以及全基因組范圍內(nèi)的甲基化水平，評估兩種芯片的性能差異。同時將ONT測序數(shù)據(jù)與PacBio長讀長測序和Illumina亞硫酸鹽測序數(shù)據(jù)進行對比分析，以驗證甲基化檢測的準(zhǔn)確性和一致性。
結(jié)果圖形
（1）ONT測序技術(shù)改進
研究首先分別使用R9和R10芯片的ONT技術(shù)對HG002細胞系進行測序質(zhì)量比較。分析結(jié)果表明，R10數(shù)據(jù)在準(zhǔn)確性和讀長方面均顯著提升。R10數(shù)據(jù)的比對一致性中位數(shù)較高，達到98.72%，而R9數(shù)據(jù)為95.05%。此外R10數(shù)據(jù)在變異檢測中也表現(xiàn)出更高準(zhǔn)確性。這些改進研究結(jié)果表明，R10芯片在提高測序準(zhǔn)確性和檢測能力中具有顯著優(yōu)勢。
（2）R9與R10 ONT數(shù)據(jù)的甲基化檢測比較
研究利用HG002細胞系R9和R10數(shù)據(jù)中的甲基化信息與全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）數(shù)據(jù)進行比較分析。分析結(jié)果揭示R10數(shù)據(jù)在甲基化檢測方面與WGBS數(shù)據(jù)具有更高的相關(guān)性（Pearson r = 0.969），高于R9數(shù)據(jù)的相關(guān)性。此外，R10數(shù)據(jù)在低甲基化（0%–10%）和高甲基化（90%–100%）區(qū)域的檢測比例上與R9數(shù)據(jù)存在顯著上升，表明R10在甲基化極值檢測上更為準(zhǔn)確。
圖1：在HG002細胞系、血液和大腦樣本中對R9和R10數(shù)據(jù)集的DNA甲基化檢測結(jié)果進行總體比較。
（A）HG002細胞系的R9（橙色）和R10（藍色）數(shù)據(jù)的甲基化水平，數(shù)據(jù)按照亞硫酸鹽（綠色）甲基化區(qū)間分箱。R9和R10甲基化分布中與亞硫酸鹽甲基化范圍一致的部分以綠色突出顯示。
（B–D）小提琴圖顯示HG002細胞系（B）、大腦樣本（C）和血液樣本（D）的R9和R10數(shù)據(jù)的甲基化水平，數(shù)據(jù)按照R9區(qū)間分箱。每個小提琴圖都用線連接中位數(shù)區(qū)間點以可視化甲基化趨勢。右側(cè)展示CpG位點甲基化頻率分布。
（E）堆疊條形圖展示每種技術(shù)、每個樣本的總CpG位點的分布情況。
（3）R9與R10甲基化差異特征分析
研究進一步分析了R9和R10數(shù)據(jù)在同聚物區(qū)域的甲基化檢測差異。分析結(jié)果顯示，R10數(shù)據(jù)在同聚物區(qū)域的甲基化檢測上具有更高的分辨率，能夠更準(zhǔn)確鑒定出甲基化狀態(tài)。此外R10數(shù)據(jù)在基因啟動子區(qū)域和CpG島的甲基化檢測上也表現(xiàn)出更高準(zhǔn)確性，表明R10芯片檢測復(fù)雜基因組區(qū)域甲基化具有顯著優(yōu)勢。
圖2：HG002 R9和R10數(shù)據(jù)集的全基因組及區(qū)域甲基化檢測。
（A）HG002 R9和R10中所有CpG位點（合并鏈）的甲基化檢測結(jié)果。
（B）R9和R10的2kb全基因組窗口范圍的散點圖，每個窗口至少包含10個CpG位點。
（C、D）29124個人類啟動子區(qū)域（每個區(qū)域至少有10個CpG位點）平均甲基化水平直方圖和散點圖。
（E、F）HG002中包含至少10個CpG位點的CpG島BED區(qū)域的直方圖和散點圖。
圖3：不同測序技術(shù)對HG002永生化細胞系的甲基化檢測結(jié)果比較分析。
（A）每種技術(shù)的甲基化水平直方圖。
（B）不同技術(shù)之間的特定位點CpG甲基化水平成對比較分析。
（C）R10與亞硫酸鹽測序之間的特定位點CpG甲基化水平比較分析。
（D）在BisMap定義的Illumina 150 bp成對比對區(qū)域中，不同技術(shù)之間的成對比較RMSE值。
（E）在Illumina 150 bp不能成對比對區(qū)域中，不同技術(shù)之間的成對比較RMSE值。
（4）人類原代血液和大腦組織樣本的甲基化比較
研究還評估了R9和R10芯片在人類原代血液和大腦組織樣本中的甲基化檢測性能。分析結(jié)果表明，R10數(shù)據(jù)對大腦和血液樣本的甲基化檢測均表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確性和覆蓋深度。R10數(shù)據(jù)在檢測甲基化極值（0%和100%）中靈敏度更高，有助于提高鑒定出甲基化水平變化的靈敏度。
圖4：細胞、血液和大腦樣本之間的單倍型特異性甲基化差異與共性。從上到下每圖顯示基因組坐標(biāo)、標(biāo)記的基因模型（若有）、帶有修飾堿基的單倍型感知reads比對（黑色表示甲基化，彩色表示未甲基化），平滑的甲基化水平圖和覆蓋深度圖。底部坐標(biāo)表示平滑甲基化圖中使用的甲基化分箱。
（A）HG002細胞系R9和R10測序的單倍型特異性甲基化差異與共性。
（B）細胞系、血液和大腦樣本R10測序的單倍型特異性甲基化差異與共性。
討論和啟示
本研究系統(tǒng)評估了牛津納米孔測序技術(shù)在檢測人類原代組織DNA甲基化中的性能，特別比較了R9和R10兩種芯片的差異。研究結(jié)果表明，R10芯片在提高測序準(zhǔn)確性和甲基化檢測能力方面具有顯著優(yōu)勢。此外研究還發(fā)現(xiàn)，不同測序技術(shù)（如ONT、PacBio和Illumina）在甲基化檢測上存在一定差異，在不同平臺上的產(chǎn)生的數(shù)據(jù)差異，值得深入探究。未來研究應(yīng)進一步探索不同測序技術(shù)在甲基化檢測中的應(yīng)用，并優(yōu)化數(shù)據(jù)分析策略，以提高甲基化檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。
參考文獻：
Genner R, Akeson S, Meredith M, Jerez PA, Malik L, Baker B, Miano-Burkhardt A, CARD-long-read Team, Paten B, Billingsley KJ, Blauwendraat C, Jain M. Assessing DNA methylation detection for primary human tissue using nanopore sequencing. Genome Res. 2025 Mar 7. doi: 10.1101/gr.279159.124.
doi: 10.1101/gr.279159.124
近年來，ONT和PacBio單分子測序技術(shù)促進了長讀長天然DNA分子（包括胞嘧啶甲基化）測序的發(fā)展。特別是ONT最近將其納米孔測序芯片從R9版本升級到R10版本，極大提高了測序的準(zhǔn)確性和通量水平。但這種升級對甲基化檢測的作用尚未被報道。本研究比較了ONT納米孔測序R9和R10芯片對三種人類基因組數(shù)據(jù)集（體外細胞系樣本、大腦前額葉皮層樣本和血液樣本）的5mC檢測結(jié)果差異。研究者對CpG島和同聚物區(qū)域進行深入分析，并比較不同測序技術(shù)之間甲基化檢測數(shù)據(jù)的一致性，分析結(jié)果表明在體外細胞系數(shù)據(jù)集中，ONTR10芯片與Illumina亞硫酸鹽測序技術(shù)之間的相關(guān)性最強。
易小結(jié)
本研究通過對比ONT納米孔測序技術(shù)的R9和R10芯片，揭示了ONT R10芯片在檢測人類原代組織DNA甲基化中的顯著優(yōu)勢，特別是在提高測序準(zhǔn)確性和檢測極值甲基化水平（0%和100%）方面表現(xiàn)優(yōu)異，為表觀遺傳學(xué)研究提供了更精準(zhǔn)工具。
ONT長讀長測序能夠直接檢測DNA序列及其修飾，無需額外樣本處理，極大簡化了表觀遺傳學(xué)研究流程。研究不僅驗證了ONT R10在甲基化檢測中的高效性和準(zhǔn)確性，還為未來大規(guī)模基因組測序項目（如隊列研究）提供了重要的技術(shù)參考。
易基因作為專注于表觀基因組技術(shù)的公司，其相關(guān)業(yè)務(wù)產(chǎn)品如ONT R10長讀長測序、全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）等，可為客戶提供更全面、更精準(zhǔn)的表觀遺傳學(xué)解決方案，助力在基因調(diào)控、疾病機制和藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域取得突破性進展。
研究方法
樣本收集與測序：人血液、大腦和體外細胞系樣本。
數(shù)據(jù)處理與分析：R9樣本使用Guppy v6.1.2進行堿基識別，R10樣本使用Guppy v6.3.8進行堿基識別。使用minimap2將reads比對至GRCh38人類參考基因組，并使用Modkit工具從比對后的BAM文件中提取甲基化信息。此外還使用DeepVariant和Sniffles2進行變異檢測。
甲基化檢測與比較：通過比較R9和R10測序數(shù)據(jù)在CpG島、同聚物區(qū)域以及全基因組范圍內(nèi)的甲基化水平，評估兩種芯片的性能差異。同時將ONT測序數(shù)據(jù)與PacBio長讀長測序和Illumina亞硫酸鹽測序數(shù)據(jù)進行對比分析，以驗證甲基化檢測的準(zhǔn)確性和一致性。
結(jié)果圖形
（1）ONT測序技術(shù)改進
研究首先分別使用R9和R10芯片的ONT技術(shù)對HG002細胞系進行測序質(zhì)量比較。分析結(jié)果表明，R10數(shù)據(jù)在準(zhǔn)確性和讀長方面均顯著提升。R10數(shù)據(jù)的比對一致性中位數(shù)較高，達到98.72%，而R9數(shù)據(jù)為95.05%。此外R10數(shù)據(jù)在變異檢測中也表現(xiàn)出更高準(zhǔn)確性。這些改進研究結(jié)果表明，R10芯片在提高測序準(zhǔn)確性和檢測能力中具有顯著優(yōu)勢。
（2）R9與R10 ONT數(shù)據(jù)的甲基化檢測比較
研究利用HG002細胞系R9和R10數(shù)據(jù)中的甲基化信息與全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）數(shù)據(jù)進行比較分析。分析結(jié)果揭示R10數(shù)據(jù)在甲基化檢測方面與WGBS數(shù)據(jù)具有更高的相關(guān)性（Pearson r = 0.969），高于R9數(shù)據(jù)的相關(guān)性。此外，R10數(shù)據(jù)在低甲基化（0%–10%）和高甲基化（90%–100%）區(qū)域的檢測比例上與R9數(shù)據(jù)存在顯著上升，表明R10在甲基化極值檢測上更為準(zhǔn)確。
圖1：在HG002細胞系、血液和大腦樣本中對R9和R10數(shù)據(jù)集的DNA甲基化檢測結(jié)果進行總體比較。（A）HG002細胞系的R9（橙色）和R10（藍色）數(shù)據(jù)的甲基化水平，數(shù)據(jù)按照亞硫酸鹽（綠色）甲基化區(qū)間分箱。R9和R10甲基化分布中與亞硫酸鹽甲基化范圍一致的部分以綠色突出顯示。
（B–D）小提琴圖顯示HG002細胞系（B）、大腦樣本（C）和血液樣本（D）的R9和R10數(shù)據(jù)的甲基化水平，數(shù)據(jù)按照R9區(qū)間分箱。每個小提琴圖都用線連接中位數(shù)區(qū)間點以可視化甲基化趨勢。右側(cè)展示CpG位點甲基化頻率分布。
（E）堆疊條形圖展示每種技術(shù)、每個樣本的總CpG位點的分布情況。
（3）R9與R10甲基化差異特征分析
研究進一步分析了R9和R10數(shù)據(jù)在同聚物區(qū)域的甲基化檢測差異。分析結(jié)果顯示，R10數(shù)據(jù)在同聚物區(qū)域的甲基化檢測上具有更高的分辨率，能夠更準(zhǔn)確鑒定出甲基化狀態(tài)。此外R10數(shù)據(jù)在基因啟動子區(qū)域和CpG島的甲基化檢測上也表現(xiàn)出更高準(zhǔn)確性，表明R10芯片檢測復(fù)雜基因組區(qū)域甲基化具有顯著優(yōu)勢。
圖2：HG002 R9和R10數(shù)據(jù)集的全基因組及區(qū)域甲基化檢測。
（A）HG002 R9和R10中所有CpG位點（合并鏈）的甲基化檢測結(jié)果。
（B）R9和R10的2kb全基因組窗口范圍的散點圖，每個窗口至少包含10個CpG位點。
（C、D）29124個人類啟動子區(qū)域（每個區(qū)域至少有10個CpG位點）平均甲基化水平直方圖和散點圖。
（E、F）HG002中包含至少10個CpG位點的CpG島BED區(qū)域的直方圖和散點圖。
圖3：不同測序技術(shù)對HG002永生化細胞系的甲基化檢測結(jié)果比較分析。
（A）每種技術(shù)的甲基化水平直方圖。
（B）不同技術(shù)之間的特定位點CpG甲基化水平成對比較分析。
（C）R10與亞硫酸鹽測序之間的特定位點CpG甲基化水平比較分析。
（D）在BisMap定義的Illumina 150 bp成對比對區(qū)域中，不同技術(shù)之間的成對比較RMSE值。
（E）在Illumina 150 bp不能成對比對區(qū)域中，不同技術(shù)之間的成對比較RMSE值。
（4）人類原代血液和大腦組織樣本的甲基化比較
研究還評估了R9和R10芯片在人類原代血液和大腦組織樣本中的甲基化檢測性能。分析結(jié)果表明，R10數(shù)據(jù)對大腦和血液樣本的甲基化檢測均表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確性和覆蓋深度。R10數(shù)據(jù)在檢測甲基化極值（0%和100%）中靈敏度更高，有助于提高鑒定出甲基化水平變化的靈敏度。
圖4：細胞、血液和大腦樣本之間的單倍型特異性甲基化差異與共性。從上到下每圖顯示基因組坐標(biāo)、標(biāo)記的基因模型（若有）、帶有修飾堿基的單倍型感知reads比對（黑色表示甲基化，彩色表示未甲基化），平滑的甲基化水平圖和覆蓋深度圖。底部坐標(biāo)表示平滑甲基化圖中使用的甲基化分箱。
（A）HG002細胞系R9和R10測序的單倍型特異性甲基化差異與共性。
（B）細胞系、血液和大腦樣本R10測序的單倍型特異性甲基化差異與共性。
討論和啟示
本研究系統(tǒng)評估了牛津納米孔測序技術(shù)在檢測人類原代組織DNA甲基化中的性能，特別比較了R9和R10兩種芯片的差異。研究結(jié)果表明，R10芯片在提高測序準(zhǔn)確性和甲基化檢測能力方面具有顯著優(yōu)勢。此外研究還發(fā)現(xiàn)，不同測序技術(shù)（如ONT、PacBio和Illumina）在甲基化檢測上存在一定差異，在不同平臺上的產(chǎn)生的數(shù)據(jù)差異，值得深入探究。未來研究應(yīng)進一步探索不同測序技術(shù)在甲基化檢測中的應(yīng)用，并優(yōu)化數(shù)據(jù)分析策略，以提高甲基化檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。
參考文獻：
Genner R, Akeson S, Meredith M, Jerez PA, Malik L, Baker B, Miano-Burkhardt A, CARD-long-read Team, Paten B, Billingsley KJ, Blauwendraat C, Jain M. Assessing DNA methylation detection for primary human tissue using nanopore sequencing. Genome Res. 2025 Mar 7. doi: 10.1101/gr.279159.124.
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