胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是美國癌癥死亡的第三大原因，為PDAC患者尋求新穎有效的治療方法是一個首要問題。由于PDAC腫瘤微環(huán)境中缺乏效應(yīng)T細胞，PDAC的免疫療法受到阻礙。鑒定免疫原性腫瘤相關(guān)抗原（TAA）和腫瘤特異性抗原（TSA）能夠克服PDAC對免疫療法耐藥性，從而開發(fā)個性化的癌癥疫苗和T細胞療法。與TAA相比，TSA新抗原因其在腫瘤組織特異性表達、在正常組織中的缺失以及在建立中心耐受的髓質(zhì)胸腺上皮細胞（mTEC）中缺乏表達而提高的免疫原性，具有更好的治療前景。在新抗原表位預(yù)測的方法選擇中，質(zhì)譜法（MS）相比于外顯子測序（WES），能夠檢測到基因突變外的多種新抗原，如翻譯后修飾、有缺陷的核糖體產(chǎn)物（DRiP）、蛋白酶體剪接和其他非基因組改變。

2025年，來自約翰斯·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的團隊在CLINICAL CANCER RESEARCH發(fā)表了題為“Comparison of Shared Class I HLA-Bound Noncanonical NeoePItopes between Normal and Neoplastic Tissues of Pancreatic Adenocarcinoma”的文章。在本研究中，作者采用MS分析方法來比較同一患者的PDAC組織及其相應(yīng)正常組織的免疫肽組，鑒定了來源于典型蛋白的單氨基酸替代的HLA I型肽段，這些肽段氨基酸改變不是由基因組突變引起的，最有可能是由涉及tRNA氨基酸誤酰化的翻譯錯誤引起的，并且肽段在多個患者間共享，可能成為非典型的共享新抗原。研究結(jié)果為開發(fā)更安全、更有效的PDAC新抗原治療方法鋪平了道路。

1、PDAC腫瘤組織中HLA-I型突變肽段鑒定

為了了解天然HLA I類限制性T細胞表位是否可以攜帶氨基酸突變，使用之前開發(fā)的基于質(zhì)譜的技術(shù)從四個人類PDAC組織樣本中建立了新的HLA I類免疫肽組。將肽長度縮小到8到11個氨基酸，我們分別從PDAC#1、2、3和4中鑒定出2358、1015、1040和1067條獨特的肽（圖1A）。其中，分別有631條（25.68%）、283條（27.88%）、311條（29.90%）和278條（25.65%）肽攜帶單個氨基酸突變（圖1A）。根據(jù)WES，通過將這些肽序列突變與體細胞錯義突變進行比較，發(fā)現(xiàn)沒有一種突變是由體細胞突變引起的，這表明產(chǎn)生這些肽段的氨基酸突變涉及其他機制。經(jīng)過親和力預(yù)測、人類蛋白圖譜分析、T2結(jié)合實驗，篩選得到3條突變肽段：PTPRZ1S1102K、CHD9A2174R、PSMB5K66V。通過熒光標(biāo)記實驗進一步預(yù)測免疫原性，其中PTPRZ1S1102K能夠引發(fā)強烈的免疫原性應(yīng)答。

圖1.從患者PDAC腫瘤樣本中鑒定具有單氨基酸突變的免疫原性HLA I型肽段

2、同一患者PDAC腫瘤和正常組織中HLA I型突變肽段鑒定

作者提取并比較了15名患者的16對PDAC腫瘤和正常組織的免疫肽組，其中9例為原發(fā)性腫瘤，與正常胰腺配對；七對是轉(zhuǎn)移性腫瘤（兩對來自肺部，五對來自肝臟）。從正常組織中的7885個獨特源蛋白中鑒定出10822條8-11mer肽，從腫瘤組織中的5930個獨特源蛋白中鑒定出8094條8-11mer肽（圖2C）。從正常組織中的3881個獨特源蛋白中鑒定出4151條8-11mer突變肽，從腫瘤組織中的3473個獨特源蛋白質(zhì)中鑒定出3669條8-11mer突變肽（圖2D）。

圖2.從患者PDAC腫瘤和正常組織中鑒定HLA I型肽段

3、PDAC腫瘤特異性突變肽在多個患者中共享

作者比較了16對樣本腫瘤和正常組織的免疫肽組，發(fā)現(xiàn)65.3%的野生型肽段和92.5%的突變肽段是腫瘤組織特有的，并且分析表明野生型和突變型肽段在腫瘤組織中更為豐富。

隨后，作者比較了原發(fā)性PDAC或轉(zhuǎn)移性PDAC中的腫瘤特異性免疫肽組，以鑒定腫瘤共享抗原。在原發(fā)性PDAC標(biāo)本中，3個或多個PDAC之間共享了6條突變肽。9名患者共享1條突變肽（ETALVELVK；白蛋白E550Q）。然而，由于該蛋白質(zhì)普遍表達，治療靶點價值有限，未進一步研究。在轉(zhuǎn)移性PDAC標(biāo)本中，2條突變肽段在3個或多個PDAC之間共享。

圖3. 腫瘤特異性HLA I型野生肽段和突變肽段

4、HLA I型突變肽段中的氨基酸替代模式

作者總結(jié)了正常或腫瘤組織特異性突變肽段常見氨基酸替代的前10名，其中，Q-E（正常組織20.44%；腫瘤組織24.59%）、N-D（正常組織23.56%；腫瘤組織19.89%）和V-L（正常組織11.33%；腫瘤組織16.85%）是腫瘤和正常組織特異性突變肽段最常見的三種氨基酸替代（圖4A和B）。盡管腫瘤和正常組織特異性突變肽段的前3名AA替代是相同的，但是有幾種氨基酸替代形式是僅在腫瘤組織中出現(xiàn)的（A-P、R-K、L-A、P-K）（圖4B）。

那么腫瘤特異性AA替代是否會影響突變肽的免疫原性。實驗結(jié)果表明41個正常組織特異性AA突變和45個腫瘤特異性AA突變能增加與HLA的親和力，腫瘤組織中這些肽段可能有更高的免疫原性，應(yīng)作為免疫治療靶點進行進一步研究。有趣的是，一些AA替代顯著降低了肽段和HLA的結(jié)合親和力，這些低親和力的肽段可能會導(dǎo)致免疫逃逸。

圖4.正常和腫瘤特異性肽段氨基酸替代模式

5、突變肽段與HLA結(jié)合親和力改變的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

為了了解突變肽段與HLA的結(jié)合親和力為何增加，作者對與相應(yīng)HLA I類分子HLA-a*33:01復(fù)合的正常和新表位肌動蛋白肽進行了分子建模，使用AlphaFold來預(yù)測結(jié)構(gòu)。野生型肌動蛋白肽的預(yù)測結(jié)合親和力為2.8μmol/L，其突變肽段的預(yù)測結(jié)合親和性要高得多，為0.5μmol/L。在突變肽段中，Q1的側(cè)鏈酰胺氮與G2羰基的羰基形成氫鍵。這種新的氫鍵在正常肽段中是不存在的，可能是突變肽段結(jié)合親和力增加的原因。

這是第一項比較同一患者腫瘤和正常組織免疫肽的研究。鑒定的單個氨基酸突變的HLA I型免疫肽不是由基因組突變引起的，最有可能是由涉及tRNA氨基酸誤?；姆g錯誤引起的。由于這些突變肽在個體患者中具有很高的腫瘤特異性，并在多個患者中共享，因此是疫苗和T細胞治療開發(fā)的新抗原候選者。