NHS活性酯熒光標記詳細步驟、常見問題及解決方案指南_abio生物試劑品牌網
標記原理
將熒光染料與蛋白，抗體及其他生物分子偶聯主要基于 NHS 酯反應化學， NHS 酯活化的熒光染料和待標記化合物在生理至弱堿性條件下（pH 7至 9）與伯胺反應，形成穩定的酰胺鍵，反應釋放出 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。從而實現與蛋白，抗體的偶聯。
圖1 NHS酯化學偶聯到伯胺的反應圖式
（R）表示具有NHS酯反應基團的熒光團
（P）表示含有伯胺的蛋白質，抗體或其他生物分子
標記前準備
1) 實驗物品準備：移液槍及一次性吸頭（0.5-10μL、2-20μL、20-200μL），恒溫孵育震蕩器，合適離心機。
2) 準備活性染料酯母液：粉末一般使用 DMSO 溶解，根據試劑的溶解性而定。母液應分裝低于-20℃保存，避免反復凍存和受潮。
3) 標記緩沖液配制：標記實驗請自行準備合適緩沖液，緩沖液應具有適宜的 pH 和成分，例如： 10-50mM 的硼酸鈉溶液，PBS或碳酸氫鈉溶液 (pH 7.5- 8.5)，應不包括Tris，氨基酸等含伯胺的物質。
4) 純化方式選擇：純化方式試實驗要求可選擇多種方式，實驗前請自行選擇純化方法。純化裝置包括 Zeba 脫鹽離心柱純化，Sephadex G-25 凝膠過濾柱純化，超濾管純化等。
注：推薦選擇超濾管純化，本司試劑盒產品配置有超濾管，超濾管使用前仔細請參看 Milipore 官網指南：Amicon Ultra-0.5 mL離心式過濾器，用于DNA和蛋白的純化及濃縮 - Sample Prep Centrifugal Filter Units (MERCKmillipore.com)
標記步驟
1 置換緩沖液（選擇性操作）
若您的抗體或蛋白濃度較低，或儲備在含有游離氨基的溶液中（Tris，氨基酸等含伯胺的物質），標記前請用標記緩沖液超濾置換抗體溶液。
2 標記反應量計算
每種染料標記比選擇取決于染料類型，蛋白類型和實驗目的，例如cy系列和蛋白最佳標記摩爾比在 1:4-1:20 。為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過預實驗進行摸索。每個標記反應染料的使用量取決于代標記蛋白的質量，濃度和分子量。在確定好大概摩爾標記比的情況下，使用以下公式進行計算染料投量：
● n(染料) 是標記抗體Ab或蛋白計算所用的染料摩爾量；單位 mmol
● m(染料) 是標記抗體Ab或蛋白計算所用的染料質量，單位 mg
● a是投料摩爾標記比（抗體：染料=1：n）
● m(Ab) 是待標記抗體 Ab 或蛋白的總質量，單位 mg
● M(Ab) 是抗體或蛋白的分子量，單位 Da
● M(染料) 是所用染料的分子量，單位 g/mol
計算好染料的摩爾使用量，換算為母液取用量，一般染料母液取用量不超過反應體系的 10% 。
● V(取母液體積) 是所取染料的體積，單位μL
● c(母液濃度),是存儲母液濃度，單位mM
3 以投料比 1:5（蛋白與染料的摩爾比）的標記實驗
取出儲存的 2mM 染料母液，染料恢復至室溫，抗體或蛋白溶液置于 300μL 的標記緩沖液反應體系，對于標記 0.1mg 的 IgG 抗體（150 KDa），立即取V = 5*0.1*106/（2*150000）μL=6.7μL，加入到體系內，震蕩均勻，染料可分多次加入震蕩，然后在室溫避光條件孵育 2 小時。
4 超濾純化（若使用超濾管）
標記反應完成后，轉移反應液后以 12000g 離心超濾15min，去除游離的染料，超濾過程輕輕混勻溶液，避免觸碰到膜，至少操作超濾 2 次至濾液無色，最后一次倒置內管超濾（4000g，1min），使濃縮后的樣本從超濾內管轉移到收集內管中，得到標記好的抗體即可使用，或置于 1%BSA 儲存液避光保存。
圖2 注：最佳標記比例可能根據蛋白的差異而不同，用戶可根據實際情況優化。超濾過程存在膜吸附，不影響后續使用。
標記比及濃度計算
1）每種染料的偶聯率在 50%-90%，真實標記比需借助紫外分光光度計測試計算。
2）使用紫外分光光度計掃描一定稀釋程度的樣本在 230nm~900nm 的吸收光譜，記錄A280的吸光度及染料最大吸收處的吸光度。
3）實驗過程請注意調整兩個吸光度值的大小范圍，使蛋白的 280nm 的吸光度盡量處于 0.1-1 范圍。
4）結合相關數據計算公式如下：
實際標記比總公式：
● A280是抗體在 280nm 的吸光度
● Aλmax是染料在最大吸收處的吸光度
● CF是染料對 280nm 處的吸光度的影響的校正因子，一般取0.03-0.07，參見染料信息
● εdye 和 εAntibody 是染料和抗體的摩爾消光系數，IgG 抗體 εAntibody 一般 210000 cm-1M-1，εdye 參見染料信息
蛋白濃度公式：
以 BLT 800 標記抗體為例標記比則為：
標記常見問題及解決方案
標記過程中蛋白出現帶顏色沉淀
? 蛋白與染料的投料摩爾比過高（蛋白濃度過高，染料濃度過高）
首先降低投料摩爾比，若仍出現，降低反應體系投料蛋白量和相應的染料量
? 反應體系存在使待標記物質聚沉的物質，可能是蛋白不耐受ph,鹽濃度，被標記后在體系聚沉
改變相應條件嘗試
? 染料分子結構特性的水溶性不高
選擇水溶性更高的染料，例如磺化的染料，但cy的波長碳鏈越長越高，水溶性越差，就算磺化后也會出現一點聚沉，只能通過其他方式減少聚沉
超濾純化過程蛋白出現聚沉
? 蛋白不兼容pH
調整 pH 在適合范圍
? 超濾過程蛋白濃度變化太大
注意一次標記的蛋白濃度
超濾純化過程較慢
? 轉速不合適，超濾管截留分子量選擇不當
轉速單位調為 xg 單位，若為 150KDa 的抗體，可更換超濾管 100KDa
蛋白標記比較低
? 活性染料儲存使用不當，NHS活性酯遇水活性鍵在幾分鐘或幾小時完全失活，使得無法標記
活性染料注意防潮，平衡室溫再打開
? 標記過程操作細節不當
請按照說明書調整，注意細節
? 蛋白緩沖液含有干擾組分如過量銨離子或含氨基物質
標記蛋白前正確置換緩沖液
? 光譜測定方法不準確
請按照正確的吸收光譜方法測定
較低蛋白回收率
? 超濾膜損破（轉速過高破損）或過多裝液體漏液
檢查超濾膜及管芯不要裝過多液體
? 回收蛋白不當
采取倒置離心回收蛋白
? 標記過程或超濾過程，蛋白發生聚沉
超濾過程每管降低蛋白濃度，或加入少量氯化銨（20mM）及時終止反應
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BLTDye 800 標記試劑盒
Cy系列染料
AF系列染料
ATTO系列染料
注：博鷺騰熒光標記試劑盒暫時提供近紅外二區熒光染料標記的全套試劑盒，對于其他波長范圍的熒光標記，博鷺騰有熒光染料NHS活性酯產品，對標記過程稍加修改也可做此類標記。
將熒光染料與蛋白，抗體及其他生物分子偶聯主要基于 NHS 酯反應化學， NHS 酯活化的熒光染料和待標記化合物在生理至弱堿性條件下（pH 7至 9）與伯胺反應，形成穩定的酰胺鍵，反應釋放出 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。從而實現與蛋白，抗體的偶聯。
圖1 NHS酯化學偶聯到伯胺的反應圖式（R）表示具有NHS酯反應基團的熒光團
（P）表示含有伯胺的蛋白質，抗體或其他生物分子
標記前準備
1) 實驗物品準備：移液槍及一次性吸頭（0.5-10μL、2-20μL、20-200μL），恒溫孵育震蕩器，合適離心機。
2) 準備活性染料酯母液：粉末一般使用 DMSO 溶解，根據試劑的溶解性而定。母液應分裝低于-20℃保存，避免反復凍存和受潮。
3) 標記緩沖液配制：標記實驗請自行準備合適緩沖液，緩沖液應具有適宜的 pH 和成分，例如： 10-50mM 的硼酸鈉溶液，PBS或碳酸氫鈉溶液 (pH 7.5- 8.5)，應不包括Tris，氨基酸等含伯胺的物質。
4) 純化方式選擇：純化方式試實驗要求可選擇多種方式，實驗前請自行選擇純化方法。純化裝置包括 Zeba 脫鹽離心柱純化，Sephadex G-25 凝膠過濾柱純化，超濾管純化等。
注：推薦選擇超濾管純化，本司試劑盒產品配置有超濾管，超濾管使用前仔細請參看 Milipore 官網指南：Amicon Ultra-0.5 mL離心式過濾器，用于DNA和蛋白的純化及濃縮 - Sample Prep Centrifugal Filter Units (MERCKmillipore.com)
標記步驟
1 置換緩沖液（選擇性操作）
若您的抗體或蛋白濃度較低，或儲備在含有游離氨基的溶液中（Tris，氨基酸等含伯胺的物質），標記前請用標記緩沖液超濾置換抗體溶液。
2 標記反應量計算
每種染料標記比選擇取決于染料類型，蛋白類型和實驗目的，例如cy系列和蛋白最佳標記摩爾比在 1:4-1:20 。為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過預實驗進行摸索。每個標記反應染料的使用量取決于代標記蛋白的質量，濃度和分子量。在確定好大概摩爾標記比的情況下，使用以下公式進行計算染料投量：
● n(染料) 是標記抗體Ab或蛋白計算所用的染料摩爾量；單位 mmol● m(染料) 是標記抗體Ab或蛋白計算所用的染料質量，單位 mg
● a是投料摩爾標記比（抗體：染料=1：n）
● m(Ab) 是待標記抗體 Ab 或蛋白的總質量，單位 mg
● M(Ab) 是抗體或蛋白的分子量，單位 Da
● M(染料) 是所用染料的分子量，單位 g/mol
計算好染料的摩爾使用量，換算為母液取用量，一般染料母液取用量不超過反應體系的 10% 。
● V(取母液體積) 是所取染料的體積，單位μL● c(母液濃度),是存儲母液濃度，單位mM
3 以投料比 1:5（蛋白與染料的摩爾比）的標記實驗
取出儲存的 2mM 染料母液，染料恢復至室溫，抗體或蛋白溶液置于 300μL 的標記緩沖液反應體系，對于標記 0.1mg 的 IgG 抗體（150 KDa），立即取V = 5*0.1*106/（2*150000）μL=6.7μL，加入到體系內，震蕩均勻，染料可分多次加入震蕩，然后在室溫避光條件孵育 2 小時。
4 超濾純化（若使用超濾管）
標記反應完成后，轉移反應液后以 12000g 離心超濾15min，去除游離的染料，超濾過程輕輕混勻溶液，避免觸碰到膜，至少操作超濾 2 次至濾液無色，最后一次倒置內管超濾（4000g，1min），使濃縮后的樣本從超濾內管轉移到收集內管中，得到標記好的抗體即可使用，或置于 1%BSA 儲存液避光保存。
圖2 注：最佳標記比例可能根據蛋白的差異而不同，用戶可根據實際情況優化。超濾過程存在膜吸附，不影響后續使用。標記比及濃度計算
1）每種染料的偶聯率在 50%-90%，真實標記比需借助紫外分光光度計測試計算。
2）使用紫外分光光度計掃描一定稀釋程度的樣本在 230nm~900nm 的吸收光譜，記錄A280的吸光度及染料最大吸收處的吸光度。
3）實驗過程請注意調整兩個吸光度值的大小范圍，使蛋白的 280nm 的吸光度盡量處于 0.1-1 范圍。
4）結合相關數據計算公式如下：
實際標記比總公式：
● A280是抗體在 280nm 的吸光度● Aλmax是染料在最大吸收處的吸光度
● CF是染料對 280nm 處的吸光度的影響的校正因子，一般取0.03-0.07，參見染料信息
● εdye 和 εAntibody 是染料和抗體的摩爾消光系數，IgG 抗體 εAntibody 一般 210000 cm-1M-1，εdye 參見染料信息
蛋白濃度公式：
以 BLT 800 標記抗體為例標記比則為：
標記常見問題及解決方案
標記過程中蛋白出現帶顏色沉淀
? 蛋白與染料的投料摩爾比過高（蛋白濃度過高，染料濃度過高）
首先降低投料摩爾比，若仍出現，降低反應體系投料蛋白量和相應的染料量
? 反應體系存在使待標記物質聚沉的物質，可能是蛋白不耐受ph,鹽濃度，被標記后在體系聚沉
改變相應條件嘗試
? 染料分子結構特性的水溶性不高
選擇水溶性更高的染料，例如磺化的染料，但cy的波長碳鏈越長越高，水溶性越差，就算磺化后也會出現一點聚沉，只能通過其他方式減少聚沉
超濾純化過程蛋白出現聚沉
? 蛋白不兼容pH
調整 pH 在適合范圍
? 超濾過程蛋白濃度變化太大
注意一次標記的蛋白濃度
超濾純化過程較慢
? 轉速不合適，超濾管截留分子量選擇不當
轉速單位調為 xg 單位，若為 150KDa 的抗體，可更換超濾管 100KDa
蛋白標記比較低
? 活性染料儲存使用不當，NHS活性酯遇水活性鍵在幾分鐘或幾小時完全失活，使得無法標記
活性染料注意防潮，平衡室溫再打開
? 標記過程操作細節不當
請按照說明書調整，注意細節
? 蛋白緩沖液含有干擾組分如過量銨離子或含氨基物質
標記蛋白前正確置換緩沖液
? 光譜測定方法不準確
請按照正確的吸收光譜方法測定
較低蛋白回收率
? 超濾膜損破（轉速過高破損）或過多裝液體漏液
檢查超濾膜及管芯不要裝過多液體
? 回收蛋白不當
采取倒置離心回收蛋白
? 標記過程或超濾過程，蛋白發生聚沉
超濾過程每管降低蛋白濃度，或加入少量氯化銨（20mM）及時終止反應
博鷺騰相關試劑推薦
BLTDye 800 標記試劑盒
Cy系列染料
AF系列染料
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注：博鷺騰熒光標記試劑盒暫時提供近紅外二區熒光染料標記的全套試劑盒，對于其他波長范圍的熒光標記，博鷺騰有熒光染料NHS活性酯產品，對標記過程稍加修改也可做此類標記。
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