在蛋白功能研究中，親和力測定是揭示分子互作機制的關鍵環節。然而，傳統方法通常依賴高純度蛋白，而許多蛋白如膜蛋白、低溶解度蛋白等的研究就受到了限制。微量熱泳動技術 (MST) 以其高靈敏度、低樣本需求和對粗樣品的兼容性，不僅可以檢測重組蛋白，還為難純化蛋白的親和力測定提供了突破性的解決方案。

Section.01
微量熱泳動 (MST)

微量熱泳動（Microscale Thermophoresis, MST）是一種通過監測溫度梯度場中生物分子的遷移行為來研究分子互作的技術。該技術利用熒光標記，精確捕捉分子在熱泳動效應下的運動變化，從而實現對結合親和力的高靈敏度定量分析。

MST 技術通過紅外激光在樣品溶液中建立局部溫度場實現分子相互作用分析。實驗時，將一個分子（如蛋白）用熒光染料標記或融合 GFP 標簽，與待測分子按濃度梯度置于毛細管中。當激光聚焦加熱時，會在照射區域形成溫度梯度分布，分子由高溫區域向低溫區域定向遷移，其遷移的程度與質量、帶電性及分子間相互作用密切相關，通過檢測熒光標記的分子或天然熒光分子的熒光信號，可以獲得分子間結合的親和力常數 Kd。

圖 1. MST 技術示意圖。

Section.02
方案一: 直接檢測重組蛋白

實驗流程

 
案例一

2024 年，研究人員在 Cell 上發表了題為 "A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism" 的研究論文，揭示了 Cholesin（腸抑脂素）通過與 GPR146 蛋白結合，可抑制肝臟中的 PKA-ERK1/2 信號傳導，從而控制膽固醇的合成，最終降低循環膽固醇水平^[1]。

圖 2. MST 檢測 Cholesin 和 GPR146 (WT or Mut) 蛋白的親和力^[1]。

本研究中，作者使用 MST 技術定量測定了 Cholesin 與 GPR146（WT）蛋白的親和力，測得平衡解離常數 Kd 值為 21.34 ± 0.98 nM，表明兩者具有很高的親和力。

為了確定關鍵結合位點，作者基于 AlphaFold 預測的 GPR146 蛋白結構，構建了多個突變體，并通過 MST 檢測 GPR146（Mut）蛋白與 Cholesin 的親和力。結果顯示，突變體蛋白測定的 Kd 值顯著降低，為 971.0 ± 91.5 nM，證實了突變氨基酸對二者結合的重要性，為膽固醇代謝調控機制提供了分子層面的證據。

Section.03
方案二: 使用細胞裂解液檢測

實驗流程

 
案例一

2024 年，研究人員在 Nature 上發表了題為 "Glutamate acts on acid-sensing ion channels to worsen ischaemic brAIn injury" 的研究論文，揭示了谷氨酸不僅通過 N-甲基-D-天冬氨酸受體 (NMDAR) 激活細胞死亡通路，還可通過增強酸敏感離子通道(ASICs) 的電流，加劇缺血性腦損傷，為開發更有效的中風治療藥物提供了新的靶點^[2]。

圖 3. 不同 pH 條件下，谷氨酸和 ASIC1a 的 MST 檢測結果^[2]。

作者構建了 ASIC1a（酸敏感離子通道 1a 亞型）與 GFP（綠色熒光蛋白）的融合質粒，并將其轉染至 HEK293T 細胞中。隨后，細胞被裂解，離心后取上清液，直接使用細胞裂解液進行 MST 實驗。實驗證明，在 pH 6.8 和 pH 7.0 的條件下，谷氨酸與 hASIC1a-GFP 結合，測得的親和力（Kd）分別為 113.3 μM 和 392.5 μM，表明谷氨酸在較低的 pH 下結合更強。

案例二

2023 年，研究人員在 Cell Chem Biol 上發表了題為 "Ainsliadimer A induces ROS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells via directly targeting peroxiredoxin 1 and 2" 的研究論文，報道了一種具有抗腫瘤活性的倍半萜內酯二聚體 ainsliadimer A (AIN)，其通過直接靶向 PRDX1 和 PRDX2 蛋白，抑制它們的過氧化物酶活性，進而抑制結直腸癌細胞增殖并誘導凋亡，同時抑制小鼠腫瘤生長和腫瘤類器官模型生長^[3]。

圖 4. AIN 與 PRDX1、PRDX2 重組蛋白的 MST 檢測結果^[3]。

作者首先通過 MST 檢測發現，AIN 與重組蛋白 PRDX1 和 PRDX2 均能結合，Kd 值分別為 1.66 μM 和 9.35 μM。隨后，為了確定 AIN 分別與 2 個蛋白的結合位點，作者利用細胞裂解液檢測了野生型與突變型 PRDX1/2-GFP 與 AIN 的結合。結果表明，PRDX1 的 Cys173 和 PRDX2 的 Cys172 是 AIN 的關鍵結合位點，突變這兩個位點后，AIN與 PRDX1 和 PRDX2 蛋白均不結合。

圖 5. AIN 與 PRDX1-GFP、PRDX2-GFP 的 MST 檢測結果^[3]。

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[1] Hu X.L, et al. A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism. Cell. 2024 Mar 28;187(7):1685-1700.e18.
[2] Lai K, et al. Glutamate acts on acid-sensing ion channels to worsen ischaemic brain injury. Nature. 2024 Jul;631(8022):826-834.
[3] Lv C, et al. Ainsliadimer A induces ROS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells via directly targeting peroxiredoxin 1 and 2. Cell Chem Biol. 2023 Mar 16;30(3):295-307.e5.