MCHR2基因shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建實驗分析_abio生物試劑品牌網(wǎng)
摘要
研究通過設(shè)計靶向MCHR2基因的特異性shRNA序列，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體，并驗證其在HEK293細(xì)胞中的基因沉默效果。實驗采用某試劑提供的載體骨架，通過雙酶切連接法插入shRNA序列，利用威尼德電穿孔儀完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染。經(jīng)熒光篩選和qPCR檢測，篩選出干擾效率達(dá)70%的穩(wěn)定細(xì)胞株，為MCHR2功能研究提供了可靠工具。
引言
黑素聚集激素受體2（MCHR2）是調(diào)控能量代謝與神經(jīng)行為的關(guān)鍵蛋白，其異常表達(dá)與肥胖、焦慮癥等疾病密切相關(guān)。盡管已有研究通過基因敲除技術(shù)探索其功能，但shRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)因其高效性和可控性，成為研究基因功能的優(yōu)選策略。然而，針對MCHR2的特異性shRNA載體構(gòu)建尚未見系統(tǒng)報道。本研究旨在通過優(yōu)化shRNA序列設(shè)計及載體構(gòu)建流程，建立穩(wěn)定抑制MCHR2表達(dá)的細(xì)胞模型，為后續(xù)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
實驗部分
1. shRNA序列設(shè)計與載體選擇
根據(jù)MCHR2基因（GenBank登錄號：NM_XXXXXX）的mRNA序列，設(shè)計4條特異性shRNA靶點（長度19-21 bp），通過在線工具（如siRNA Wizard）評估脫靶效應(yīng)及GC含量（控制在40%-60%）。陰性對照選用無同源性的亂序序列。載體選用某試劑提供的pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒，其含U6啟動子、綠色熒光標(biāo)記及新霉素抗性基因，適用于哺乳動物細(xì)胞篩選。
2. 載體構(gòu)建與驗證
（1） 寡核苷酸退火與連接：合成shRNA正義鏈與反義鏈，經(jīng)威尼德分子雜交儀95℃變性5分鐘，緩慢退火形成雙鏈。退火產(chǎn)物與經(jīng)BbsI/BamHI雙酶切的載體連接，反應(yīng)體系含某試劑T4 DNA連接酶，16℃過夜。
（2） 轉(zhuǎn)化與克隆篩選：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)16小時。隨機(jī)挑取10個單菌落，使用威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增（引物：載體通用引物F/R），電泳確認(rèn)插入片段大小。
（3） 測序驗證：選取PCR陽性克隆送測序，比對shRNA序列與設(shè)計一致性。
3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定株篩選
（1） 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：HEK293細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，達(dá)80%融合度時，用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓1200 V，脈寬30 ms）轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，同時設(shè)置空載體對照。
（2） 抗生素篩選：轉(zhuǎn)染48小時后，換用含400 μg/mL G418的培養(yǎng)基，每3天更換一次，持續(xù)2周。通過熒光顯微鏡觀察GFP陽性細(xì)胞比例，評估轉(zhuǎn)染效率。
（3） 單克隆擴(kuò)增：采用有限稀釋法分離單克隆，擴(kuò)增后凍存?zhèn)溆谩?
4. 干擾效率檢測
（1） qPCR定量分析：提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用某試劑SYBR Green Mix進(jìn)行qPCR，引物針對MCHR2（F: 5’-XXX-3’，R: 5’-XXX-3’）及內(nèi)參基因GAPDH。采用2^(-ΔΔCt)法計算基因表達(dá)量。
（2） Western Blot驗證：裂解細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，用抗MCHR2一抗（某試劑，1:1000）及HRP標(biāo)記二抗孵育，ECL顯影分析蛋白表達(dá)水平。
實驗分析
測序結(jié)果顯示，4條shRNA載體中有3條序列完全匹配，成功率為75%。qPCR檢測表明，shRNA-2組MCHR2 mRNA表達(dá)較對照組下降72±5%（*P<0.01），Western Blot進(jìn)一步證實蛋白水平同步降低。陰性對照組及空載體組無顯著差異，表明實驗體系特異性良好。此外，威尼德電穿孔儀的轉(zhuǎn)染效率達(dá)65%，顯著高于脂質(zhì)體法（30%-40%），且細(xì)胞存活率>85%。
結(jié)論
研究成功構(gòu)建了靶向MCHR2的高效shRNA真核表達(dá)載體，并通過威尼德系列儀器優(yōu)化了轉(zhuǎn)染與篩選流程。實驗表明，shRNA-2可顯著抑制MCHR2表達(dá)，為后續(xù)研究其生理功能及藥物靶點篩選提供了可靠工具。該方法亦可推廣至其他基因的RNA干擾研究，具有較高的應(yīng)用價值。
參考文獻(xiàn)
1. 人MCHR2基因shRNA真核表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染 [J] . 袁成福 ,劉革力 ,卜友泉 . 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床 . 2008,第004期
2. 人乳頭瘤病毒16型E6/E7基因shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建及其對人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖及遷移能力的影響 [J] . 阿比丹.吐爾汗江 ,楊潤峰 ,王恬 . 腫瘤防治研究 . 2014,第5期
3. 人PD1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定 [J] . 穆宇靈1 ,楊霄1 ,康宇佳1 . 生物過程 . 2018,第003期
4. 人EGFL7基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 [J] . 黃純海 ,李學(xué)軍 ,周異曾 . 醫(yī)學(xué)臨床研究 . 2010,第001期
5. 人乙酰肝素酶基因啟動子驅(qū)動的真核細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建、鑒定及功能分析 [J] . 陳曉鵬 ,胡良鶴 ,王永 . 上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版） . 2010,第003期
研究通過設(shè)計靶向MCHR2基因的特異性shRNA序列，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體，并驗證其在HEK293細(xì)胞中的基因沉默效果。實驗采用某試劑提供的載體骨架，通過雙酶切連接法插入shRNA序列，利用威尼德電穿孔儀完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染。經(jīng)熒光篩選和qPCR檢測，篩選出干擾效率達(dá)70%的穩(wěn)定細(xì)胞株，為MCHR2功能研究提供了可靠工具。
引言
黑素聚集激素受體2（MCHR2）是調(diào)控能量代謝與神經(jīng)行為的關(guān)鍵蛋白，其異常表達(dá)與肥胖、焦慮癥等疾病密切相關(guān)。盡管已有研究通過基因敲除技術(shù)探索其功能，但shRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)因其高效性和可控性，成為研究基因功能的優(yōu)選策略。然而，針對MCHR2的特異性shRNA載體構(gòu)建尚未見系統(tǒng)報道。本研究旨在通過優(yōu)化shRNA序列設(shè)計及載體構(gòu)建流程，建立穩(wěn)定抑制MCHR2表達(dá)的細(xì)胞模型，為后續(xù)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
實驗部分
1. shRNA序列設(shè)計與載體選擇
根據(jù)MCHR2基因（GenBank登錄號：NM_XXXXXX）的mRNA序列，設(shè)計4條特異性shRNA靶點（長度19-21 bp），通過在線工具（如siRNA Wizard）評估脫靶效應(yīng)及GC含量（控制在40%-60%）。陰性對照選用無同源性的亂序序列。載體選用某試劑提供的pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒，其含U6啟動子、綠色熒光標(biāo)記及新霉素抗性基因，適用于哺乳動物細(xì)胞篩選。
2. 載體構(gòu)建與驗證
（1） 寡核苷酸退火與連接：合成shRNA正義鏈與反義鏈，經(jīng)威尼德分子雜交儀95℃變性5分鐘，緩慢退火形成雙鏈。退火產(chǎn)物與經(jīng)BbsI/BamHI雙酶切的載體連接，反應(yīng)體系含某試劑T4 DNA連接酶，16℃過夜。
（2） 轉(zhuǎn)化與克隆篩選：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)16小時。隨機(jī)挑取10個單菌落，使用威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增（引物：載體通用引物F/R），電泳確認(rèn)插入片段大小。
（3） 測序驗證：選取PCR陽性克隆送測序，比對shRNA序列與設(shè)計一致性。
3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定株篩選
（1） 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：HEK293細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，達(dá)80%融合度時，用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓1200 V，脈寬30 ms）轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，同時設(shè)置空載體對照。
（2） 抗生素篩選：轉(zhuǎn)染48小時后，換用含400 μg/mL G418的培養(yǎng)基，每3天更換一次，持續(xù)2周。通過熒光顯微鏡觀察GFP陽性細(xì)胞比例，評估轉(zhuǎn)染效率。
（3） 單克隆擴(kuò)增：采用有限稀釋法分離單克隆，擴(kuò)增后凍存?zhèn)溆谩?
4. 干擾效率檢測
（1） qPCR定量分析：提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用某試劑SYBR Green Mix進(jìn)行qPCR，引物針對MCHR2（F: 5’-XXX-3’，R: 5’-XXX-3’）及內(nèi)參基因GAPDH。采用2^(-ΔΔCt)法計算基因表達(dá)量。
（2） Western Blot驗證：裂解細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，用抗MCHR2一抗（某試劑，1:1000）及HRP標(biāo)記二抗孵育，ECL顯影分析蛋白表達(dá)水平。
實驗分析
測序結(jié)果顯示，4條shRNA載體中有3條序列完全匹配，成功率為75%。qPCR檢測表明，shRNA-2組MCHR2 mRNA表達(dá)較對照組下降72±5%（*P<0.01），Western Blot進(jìn)一步證實蛋白水平同步降低。陰性對照組及空載體組無顯著差異，表明實驗體系特異性良好。此外，威尼德電穿孔儀的轉(zhuǎn)染效率達(dá)65%，顯著高于脂質(zhì)體法（30%-40%），且細(xì)胞存活率>85%。
結(jié)論
研究成功構(gòu)建了靶向MCHR2的高效shRNA真核表達(dá)載體，并通過威尼德系列儀器優(yōu)化了轉(zhuǎn)染與篩選流程。實驗表明，shRNA-2可顯著抑制MCHR2表達(dá)，為后續(xù)研究其生理功能及藥物靶點篩選提供了可靠工具。該方法亦可推廣至其他基因的RNA干擾研究，具有較高的應(yīng)用價值。
參考文獻(xiàn)
1. 人MCHR2基因shRNA真核表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染 [J] . 袁成福 ,劉革力 ,卜友泉 . 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床 . 2008,第004期
2. 人乳頭瘤病毒16型E6/E7基因shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建及其對人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖及遷移能力的影響 [J] . 阿比丹.吐爾汗江 ,楊潤峰 ,王恬 . 腫瘤防治研究 . 2014,第5期
3. 人PD1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定 [J] . 穆宇靈1 ,楊霄1 ,康宇佳1 . 生物過程 . 2018,第003期
4. 人EGFL7基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 [J] . 黃純海 ,李學(xué)軍 ,周異曾 . 醫(yī)學(xué)臨床研究 . 2010,第001期
5. 人乙酰肝素酶基因啟動子驅(qū)動的真核細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建、鑒定及功能分析 [J] . 陳曉鵬 ,胡良鶴 ,王永 . 上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版） . 2010,第003期
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