納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）：原理、應(yīng)用與展望_abio生物試劑品牌網(wǎng)
一、引言
隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米顆粒在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)出獨特的應(yīng)用潛力，如生物醫(yī)藥、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等。在這些應(yīng)用中，精確測定納米顆粒的尺寸、濃度、表面電荷等特性至關(guān)重要，因為這些參數(shù)直接影響著納米材料的性能、穩(wěn)定性以及與生物系統(tǒng)的相互作用。傳統(tǒng)的納米顆粒分析技術(shù)，如電子顯微鏡（EM）和掃描探針顯微鏡（SPM），雖然能夠提供高分辨率的圖像，但樣品制備復(fù)雜、檢測通量低，且通常只能對靜態(tài)樣品進行分析，難以滿足對納米顆粒在溶液中動態(tài)行為研究的需求。動態(tài)光散射（DLS,圖1B）技術(shù)作為一種常用的光學(xué)集合技術(shù)，長期以來被廣泛應(yīng)用于納米顆粒分散體系的分析，能夠快速、準(zhǔn)確地測定顆粒尺寸。然而，DLS 在面對多分散樣品時可靠性下降，其獲得的強度加權(quán)平均尺寸（“z 平均”）并不總能準(zhǔn)確反映樣品的真實組成。此外，通過經(jīng)典反卷積算法對相關(guān)函數(shù)進行分析以提取例如雙峰分布的能力，實際上僅限于僅包含兩種或至多三種尺寸顆粒類型的樣品，且每種顆粒類型的尺寸差異需在實踐中大于 3:1。納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA,圖1A）的出現(xiàn)為納米顆粒的表征提供了一種全新的解決方案，它能夠?qū)崟r、逐個地跟蹤和分析納米顆粒在溶液中的布朗運動，從而獲取顆粒的尺寸、濃度等信息，彌補了傳統(tǒng)技術(shù)的諸多不足。
圖1，NTA(A)與DLS（B）的原理圖
二、NTA技術(shù)原理
NTA 技術(shù)基于激光光散射原理，一束精細(xì)聚焦的激光束穿過含有納米顆粒稀懸浮液的樣品池。激光束在液體樣品與光學(xué)元件的界面處發(fā)生折射，使其路徑接近與玻璃 - 樣品界面平行。位于光束內(nèi)的顆粒，通過與光束軸垂直對齊的常規(guī)光學(xué)顯微鏡進行可視化觀察，該顯微鏡收集視野內(nèi)每個顆粒散射的光。由于 NTA 本質(zhì)上并非成像技術(shù)，系統(tǒng)的總放大倍數(shù)相對適中，對于適當(dāng)稀釋的樣品，顆粒在顯微鏡視野內(nèi)呈現(xiàn)為在布朗運動下移動的光散射中心。拍攝一段時長通常為20 - 60秒（每秒30幀左右）的運動顆粒視頻，借助專有分析程序逐幀處理。程序自動識別、定位每個顆粒，跟蹤其幀間移動。顆粒識別閾值、相機增益與快門速度等參數(shù)可由用戶根據(jù)樣品類型調(diào)整，以優(yōu)化圖像。擴散進入散射體積的顆粒被識別并跟蹤，直至其離開光束或靠近相鄰顆粒致跟蹤終止，有效避免因顆粒軌跡交叉導(dǎo)致的錯誤結(jié)果。依據(jù)布朗運動理論，球形顆粒的擴散系數(shù)（Dt）與粒徑遵循斯托克斯 - 愛因斯坦關(guān)系：
其中KB為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，η為粘度，d為流體動力學(xué)直徑。顆粒在溶液中的布朗運動速度與其粒徑有關(guān)。較小的顆粒由于受到的流體阻力較小，布朗運動速度更快。反之，較大顆粒的布朗運動更慢。通過分析顆粒的布朗運動軌跡，可以計算出顆粒的擴散系數(shù)，進而推算出顆粒的粒徑。
三、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)的優(yōu)勢
1. 多參數(shù)同時分析能力
與傳統(tǒng)的 DLS 技術(shù)只能提供強度加權(quán)平均尺寸不同，NTA 能夠在跟蹤顆粒布朗運動計算尺寸的同時，測量顆粒散射光的強度，從而生成強度 - 尺寸二維圖。這使得即使對于非單分散的樣品，如不同直徑混合的二氧化鈦納米顆粒，也能通過二維圖更清晰地分辨出各個顆粒群體。此外，NTA 還可通過引入電極施加電場，分析帶電顆粒在電場中的電泳遷移率，實現(xiàn)顆粒尺寸與電泳遷移率的同時測量。以羧化的 150nm 顆粒為例，在施加電場前，可通過分析其布朗運動確定顆粒大小，施加 30V 電場后，顆粒向陽極移動，其電泳軌跡可被可視化并分析，且布朗運動不受電泳運動的影響，能夠同時提取顆粒的尺寸和電泳信息。
2. 高分辨率的顆粒尺寸分布測定
NTA 技術(shù)能夠以超越 DLS 的分辨率分辨不同顆粒尺寸，對于多分散體系具有顯著優(yōu)勢。如對 100nm 和 300nm 聚苯乙烯校準(zhǔn)微球的混合物進行分析，能夠清晰地呈現(xiàn)出雙峰分布，并且以顆粒數(shù)量為函數(shù)展示尺寸分布，可準(zhǔn)確獲得每個尺寸類別的顆粒濃度（顆粒數(shù)/ml），為復(fù)雜樣品中不同尺寸顆粒群體的定量分析提供了有力手段。
3. 實時監(jiān)測顆粒動態(tài)變化
NTA 通過光學(xué)顯微鏡成像和顆粒追蹤算法，能夠直觀地觀察到納米顆粒在溶液中的運動軌跡和行為，可實時監(jiān)測納米顆粒的聚集、分散等動態(tài)過程，有助于深入理解納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)和行為變化。由于 NTA 是對單個顆粒進行實時跟蹤分析，它能夠捕捉到顆粒在溶液中的動態(tài)變化過程。例如，在研究病毒顆粒與金屬鹽溶液相互作用時，隨著時間推移，病毒顆粒表面形成金屬涂層，導(dǎo)致其折射率增加，雖然顆粒直徑無顯著變化，但通過 NTA 的二維強度 - 尺寸圖可實時觀察到這一變化，直觀地反映出顆粒性質(zhì)的動態(tài)演變。
四、 NTA儀器構(gòu)成
典型的NTA儀器主要由激光光源、顯微鏡、樣品池、相機及數(shù)據(jù)分析軟件組成（圖2）。激光光源提供穩(wěn)定且聚焦良好的光束；顯微鏡用于觀察顆粒散射光，其光學(xué)性能影響顆粒可視化效果；樣品池容積約250μl、深度500μm，帶有Luer接口，方便通過注射器進樣，且能確保樣品在分析前20秒達到熱平衡；相機（CCD或CMOS相機）捕捉顆粒散射光圖像，其靈敏度與幀率對數(shù)據(jù)采集質(zhì)量關(guān)鍵；數(shù)據(jù)分析軟件則負(fù)責(zé)處理視頻數(shù)據(jù)，實現(xiàn)顆粒追蹤、參數(shù)計算與結(jié)果呈現(xiàn)。
圖2，NTA的結(jié)構(gòu)示意圖
五、NTA技術(shù)在多領(lǐng)域的應(yīng)用進展
納米顆粒跟蹤分析儀的用途非常廣泛，在科研系統(tǒng)的研究領(lǐng)域里，可以在脂質(zhì)體和藥物傳遞納米顆粒、蛋白質(zhì)聚集物、10-1000nm金屬和無機納米顆粒、高分子納米懸浮液、稀土納米顆粒及量子點/多層碳納米管、疫苗研發(fā)、納米氣泡、納米毒理學(xué)和生物標(biāo)記物、細(xì)胞外泡(外泌體和微泡)等領(lǐng)域進行粒徑大小測量、濃度測量、熒光純度檢測及Zeta電位測量。因此其在生物醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)、納米材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、化學(xué)工程等領(lǐng)域廣泛使用。
圖3、NTA的應(yīng)用領(lǐng)域 1. 藥物遞送
通過精確測量顆粒尺寸分布和濃度，研究人員可以更好地優(yōu)化遞送載體的設(shè)計和制備工藝，確保藥物能夠以合適的粒徑和濃度到達目標(biāo)部位，從而提高藥物的療效和安全性，這也是在藥物研發(fā)過程中對這些參數(shù)進行測量具有重要意義的原因。
2. 材料科學(xué)領(lǐng)域
在納米材料合成與表征中，NTA用于實時監(jiān)測納米顆粒生長過程，追蹤粒徑、濃度隨時間變化，助力優(yōu)化合成工藝參數(shù)，如制備金納米顆粒時，精確調(diào)控粒徑分布。在材料穩(wěn)定性研究方面，可檢測顆粒團聚、沉降等變化，評估不同環(huán)境條件（溫度、pH、離子強度）對材料穩(wěn)定性影響，為納米材料長期儲存與應(yīng)用提供依據(jù)。
3. 病毒學(xué)與疫苗生產(chǎn)
準(zhǔn)確計數(shù)和測量病毒、噬菌體及其聚集體對于疫苗研發(fā)、生產(chǎn)及質(zhì)量控制至關(guān)重要，保障疫苗的質(zhì)量和穩(wěn)定性，確保疫苗在預(yù)防疾病方面的有效性和安全性。
4. 蛋白質(zhì)聚集物
在細(xì)胞培養(yǎng)、純化、配方、包裝和儲存等多個單元操作過程中都可能發(fā)生蛋白質(zhì)聚集。確定蛋白質(zhì)聚集的狀態(tài)和動力學(xué)對于提高產(chǎn)品穩(wěn)定性和優(yōu)化生產(chǎn)過程具有重要意義。
5. 環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域
監(jiān)測環(huán)境水樣、大氣顆粒物中的納米顆粒，分析其來源、成分、遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。如研究水中金屬納米顆粒污染，NTA結(jié)合其他分析技術(shù)，識別顆粒種類、粒徑范圍，評估潛在生態(tài)風(fēng)險，為環(huán)境監(jiān)測與污染治理提供數(shù)據(jù)支持。
6. 納米氣泡
納米氣泡具有廣泛的應(yīng)用潛力，包括在藥物遞送、清潔和消毒等方面。NTA技術(shù)在納米氣泡研究中發(fā)揮著重要作用，它能夠直接在溶液中可視化納米氣泡，并提供關(guān)于氣泡尺寸和濃度的信息。
7. 外泌體外囊泡
保證外泌體的原始狀態(tài)條件下，對外泌體，外囊泡進行快速實時動態(tài)檢測，測量參數(shù)包括顆粒粒徑、散射光強、濃度等，可對抽提獲得的外泌體進行粒徑大小及數(shù)量進行統(tǒng)計。搭配響應(yīng)的激光器與濾片，可在復(fù)雜背景條件下，使用熒光抗體標(biāo)記外泌體，可對外泌體進行熒光測量。
六、總結(jié)
納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）能實現(xiàn)對單個納米顆粒的實時、同步多參數(shù)分析，提供粒徑、濃度、表面電荷等豐富信息，這是傳統(tǒng)方法難以企及的。對于多分散體系，NTA可精準(zhǔn)分辨不同粒徑顆粒群體，準(zhǔn)確反映樣品真實情況。操作相對簡便，樣品制備要求低，分析速度快，能在短時間內(nèi)給出結(jié)果，大幅提高研究效率。
隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米顆粒在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)出獨特的應(yīng)用潛力，如生物醫(yī)藥、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等。在這些應(yīng)用中，精確測定納米顆粒的尺寸、濃度、表面電荷等特性至關(guān)重要，因為這些參數(shù)直接影響著納米材料的性能、穩(wěn)定性以及與生物系統(tǒng)的相互作用。傳統(tǒng)的納米顆粒分析技術(shù)，如電子顯微鏡（EM）和掃描探針顯微鏡（SPM），雖然能夠提供高分辨率的圖像，但樣品制備復(fù)雜、檢測通量低，且通常只能對靜態(tài)樣品進行分析，難以滿足對納米顆粒在溶液中動態(tài)行為研究的需求。動態(tài)光散射（DLS,圖1B）技術(shù)作為一種常用的光學(xué)集合技術(shù)，長期以來被廣泛應(yīng)用于納米顆粒分散體系的分析，能夠快速、準(zhǔn)確地測定顆粒尺寸。然而，DLS 在面對多分散樣品時可靠性下降，其獲得的強度加權(quán)平均尺寸（“z 平均”）并不總能準(zhǔn)確反映樣品的真實組成。此外，通過經(jīng)典反卷積算法對相關(guān)函數(shù)進行分析以提取例如雙峰分布的能力，實際上僅限于僅包含兩種或至多三種尺寸顆粒類型的樣品，且每種顆粒類型的尺寸差異需在實踐中大于 3:1。納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA,圖1A）的出現(xiàn)為納米顆粒的表征提供了一種全新的解決方案，它能夠?qū)崟r、逐個地跟蹤和分析納米顆粒在溶液中的布朗運動，從而獲取顆粒的尺寸、濃度等信息，彌補了傳統(tǒng)技術(shù)的諸多不足。
圖1，NTA(A)與DLS（B）的原理圖
二、NTA技術(shù)原理
NTA 技術(shù)基于激光光散射原理，一束精細(xì)聚焦的激光束穿過含有納米顆粒稀懸浮液的樣品池。激光束在液體樣品與光學(xué)元件的界面處發(fā)生折射，使其路徑接近與玻璃 - 樣品界面平行。位于光束內(nèi)的顆粒，通過與光束軸垂直對齊的常規(guī)光學(xué)顯微鏡進行可視化觀察，該顯微鏡收集視野內(nèi)每個顆粒散射的光。由于 NTA 本質(zhì)上并非成像技術(shù)，系統(tǒng)的總放大倍數(shù)相對適中，對于適當(dāng)稀釋的樣品，顆粒在顯微鏡視野內(nèi)呈現(xiàn)為在布朗運動下移動的光散射中心。拍攝一段時長通常為20 - 60秒（每秒30幀左右）的運動顆粒視頻，借助專有分析程序逐幀處理。程序自動識別、定位每個顆粒，跟蹤其幀間移動。顆粒識別閾值、相機增益與快門速度等參數(shù)可由用戶根據(jù)樣品類型調(diào)整，以優(yōu)化圖像。擴散進入散射體積的顆粒被識別并跟蹤，直至其離開光束或靠近相鄰顆粒致跟蹤終止，有效避免因顆粒軌跡交叉導(dǎo)致的錯誤結(jié)果。依據(jù)布朗運動理論，球形顆粒的擴散系數(shù)（Dt）與粒徑遵循斯托克斯 - 愛因斯坦關(guān)系：
其中KB為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，η為粘度，d為流體動力學(xué)直徑。顆粒在溶液中的布朗運動速度與其粒徑有關(guān)。較小的顆粒由于受到的流體阻力較小，布朗運動速度更快。反之，較大顆粒的布朗運動更慢。通過分析顆粒的布朗運動軌跡，可以計算出顆粒的擴散系數(shù)，進而推算出顆粒的粒徑。
三、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)的優(yōu)勢
1. 多參數(shù)同時分析能力
與傳統(tǒng)的 DLS 技術(shù)只能提供強度加權(quán)平均尺寸不同，NTA 能夠在跟蹤顆粒布朗運動計算尺寸的同時，測量顆粒散射光的強度，從而生成強度 - 尺寸二維圖。這使得即使對于非單分散的樣品，如不同直徑混合的二氧化鈦納米顆粒，也能通過二維圖更清晰地分辨出各個顆粒群體。此外，NTA 還可通過引入電極施加電場，分析帶電顆粒在電場中的電泳遷移率，實現(xiàn)顆粒尺寸與電泳遷移率的同時測量。以羧化的 150nm 顆粒為例，在施加電場前，可通過分析其布朗運動確定顆粒大小，施加 30V 電場后，顆粒向陽極移動，其電泳軌跡可被可視化并分析，且布朗運動不受電泳運動的影響，能夠同時提取顆粒的尺寸和電泳信息。
2. 高分辨率的顆粒尺寸分布測定
NTA 技術(shù)能夠以超越 DLS 的分辨率分辨不同顆粒尺寸，對于多分散體系具有顯著優(yōu)勢。如對 100nm 和 300nm 聚苯乙烯校準(zhǔn)微球的混合物進行分析，能夠清晰地呈現(xiàn)出雙峰分布，并且以顆粒數(shù)量為函數(shù)展示尺寸分布，可準(zhǔn)確獲得每個尺寸類別的顆粒濃度（顆粒數(shù)/ml），為復(fù)雜樣品中不同尺寸顆粒群體的定量分析提供了有力手段。
3. 實時監(jiān)測顆粒動態(tài)變化
NTA 通過光學(xué)顯微鏡成像和顆粒追蹤算法，能夠直觀地觀察到納米顆粒在溶液中的運動軌跡和行為，可實時監(jiān)測納米顆粒的聚集、分散等動態(tài)過程，有助于深入理解納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)和行為變化。由于 NTA 是對單個顆粒進行實時跟蹤分析，它能夠捕捉到顆粒在溶液中的動態(tài)變化過程。例如，在研究病毒顆粒與金屬鹽溶液相互作用時，隨著時間推移，病毒顆粒表面形成金屬涂層，導(dǎo)致其折射率增加，雖然顆粒直徑無顯著變化，但通過 NTA 的二維強度 - 尺寸圖可實時觀察到這一變化，直觀地反映出顆粒性質(zhì)的動態(tài)演變。
四、 NTA儀器構(gòu)成
典型的NTA儀器主要由激光光源、顯微鏡、樣品池、相機及數(shù)據(jù)分析軟件組成（圖2）。激光光源提供穩(wěn)定且聚焦良好的光束；顯微鏡用于觀察顆粒散射光，其光學(xué)性能影響顆粒可視化效果；樣品池容積約250μl、深度500μm，帶有Luer接口，方便通過注射器進樣，且能確保樣品在分析前20秒達到熱平衡；相機（CCD或CMOS相機）捕捉顆粒散射光圖像，其靈敏度與幀率對數(shù)據(jù)采集質(zhì)量關(guān)鍵；數(shù)據(jù)分析軟件則負(fù)責(zé)處理視頻數(shù)據(jù)，實現(xiàn)顆粒追蹤、參數(shù)計算與結(jié)果呈現(xiàn)。
圖2，NTA的結(jié)構(gòu)示意圖
五、NTA技術(shù)在多領(lǐng)域的應(yīng)用進展
納米顆粒跟蹤分析儀的用途非常廣泛，在科研系統(tǒng)的研究領(lǐng)域里，可以在脂質(zhì)體和藥物傳遞納米顆粒、蛋白質(zhì)聚集物、10-1000nm金屬和無機納米顆粒、高分子納米懸浮液、稀土納米顆粒及量子點/多層碳納米管、疫苗研發(fā)、納米氣泡、納米毒理學(xué)和生物標(biāo)記物、細(xì)胞外泡(外泌體和微泡)等領(lǐng)域進行粒徑大小測量、濃度測量、熒光純度檢測及Zeta電位測量。因此其在生物醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)、納米材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、化學(xué)工程等領(lǐng)域廣泛使用。
圖3、NTA的應(yīng)用領(lǐng)域 1. 藥物遞送
通過精確測量顆粒尺寸分布和濃度，研究人員可以更好地優(yōu)化遞送載體的設(shè)計和制備工藝，確保藥物能夠以合適的粒徑和濃度到達目標(biāo)部位，從而提高藥物的療效和安全性，這也是在藥物研發(fā)過程中對這些參數(shù)進行測量具有重要意義的原因。
2. 材料科學(xué)領(lǐng)域
在納米材料合成與表征中，NTA用于實時監(jiān)測納米顆粒生長過程，追蹤粒徑、濃度隨時間變化，助力優(yōu)化合成工藝參數(shù)，如制備金納米顆粒時，精確調(diào)控粒徑分布。在材料穩(wěn)定性研究方面，可檢測顆粒團聚、沉降等變化，評估不同環(huán)境條件（溫度、pH、離子強度）對材料穩(wěn)定性影響，為納米材料長期儲存與應(yīng)用提供依據(jù)。
3. 病毒學(xué)與疫苗生產(chǎn)
準(zhǔn)確計數(shù)和測量病毒、噬菌體及其聚集體對于疫苗研發(fā)、生產(chǎn)及質(zhì)量控制至關(guān)重要，保障疫苗的質(zhì)量和穩(wěn)定性，確保疫苗在預(yù)防疾病方面的有效性和安全性。
4. 蛋白質(zhì)聚集物
在細(xì)胞培養(yǎng)、純化、配方、包裝和儲存等多個單元操作過程中都可能發(fā)生蛋白質(zhì)聚集。確定蛋白質(zhì)聚集的狀態(tài)和動力學(xué)對于提高產(chǎn)品穩(wěn)定性和優(yōu)化生產(chǎn)過程具有重要意義。
5. 環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域
監(jiān)測環(huán)境水樣、大氣顆粒物中的納米顆粒，分析其來源、成分、遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。如研究水中金屬納米顆粒污染，NTA結(jié)合其他分析技術(shù)，識別顆粒種類、粒徑范圍，評估潛在生態(tài)風(fēng)險，為環(huán)境監(jiān)測與污染治理提供數(shù)據(jù)支持。
6. 納米氣泡
納米氣泡具有廣泛的應(yīng)用潛力，包括在藥物遞送、清潔和消毒等方面。NTA技術(shù)在納米氣泡研究中發(fā)揮著重要作用，它能夠直接在溶液中可視化納米氣泡，并提供關(guān)于氣泡尺寸和濃度的信息。
7. 外泌體外囊泡
保證外泌體的原始狀態(tài)條件下，對外泌體，外囊泡進行快速實時動態(tài)檢測，測量參數(shù)包括顆粒粒徑、散射光強、濃度等，可對抽提獲得的外泌體進行粒徑大小及數(shù)量進行統(tǒng)計。搭配響應(yīng)的激光器與濾片，可在復(fù)雜背景條件下，使用熒光抗體標(biāo)記外泌體，可對外泌體進行熒光測量。
六、總結(jié)
納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）能實現(xiàn)對單個納米顆粒的實時、同步多參數(shù)分析，提供粒徑、濃度、表面電荷等豐富信息，這是傳統(tǒng)方法難以企及的。對于多分散體系，NTA可精準(zhǔn)分辨不同粒徑顆粒群體，準(zhǔn)確反映樣品真實情況。操作相對簡便，樣品制備要求低，分析速度快，能在短時間內(nèi)給出結(jié)果，大幅提高研究效率。
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