PIvotal role of IL-8 derived from the interaction between osteosarcoma and tumor-associated macrophages in osteosarcoma growth and metastasis via the FAK pathway

Subject terms: Bone cancer, Cancer microenvironment

骨肉瘤（OS）是困擾兒童和青少年最普遍的原發(fā)性骨腫瘤。在肉瘤中，與腫瘤類似，腫瘤微環(huán)境（TME），包括細(xì)胞外基質(zhì)、血小板、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓來源的炎癥細(xì)胞和信號分子等成分，已經(jīng)引起了人們的關(guān)注。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是 TME 的主要成分，大致可分為 M1 和 M2表型，前者具有促炎、腫瘤抑制作用，后者具有抗炎、腫瘤支持作用。此外，包括肉瘤在內(nèi)的各種 TAM 表型已被記錄，強(qiáng)調(diào)了它們在各種過程中的多方面作用，包括腫瘤生長、轉(zhuǎn)移促進(jìn)和血管生成。TAM 衍生的細(xì)胞因子在這些過程中起著核心作用。盡管研究已報(bào)道了 IL-6 在未分化多形性肉瘤（UPS）中的重要性，但 OS 中的關(guān)鍵細(xì)胞因子仍未得到充分了解。

IL-8 在炎癥組織中誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化性，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成。IL-8 在癌癥中是一種轉(zhuǎn)移性和預(yù)后因子，在 OS 中可能具有類似的體外和體內(nèi)效應(yīng)。然而，控制 TME 中 IL-8 產(chǎn)生的機(jī)制及其對 OS 的影響仍不清楚。

因此，日本山梨大學(xué)骨外科、熊本大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院細(xì)胞病理學(xué)系、日本國立癌癥研究中心等課題團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)聯(lián)合研究中旨在全面闡明源自 OS 和 TAMs 之間相互作用中的 IL-8 的效應(yīng)及其對 OS 生長和轉(zhuǎn)移的影響。研究成果發(fā)表于 Cell Death & Disease 期刊題為“Pivotal role of IL-8 derived from the interaction between osteosarcoma and tumor-associated macrophages in osteosarcoma growth and metastasis via the FAK pathway”。
首先，使用免疫組織化學(xué)（IHC）比較原發(fā)性O(shè)S 患者和 OS 肺轉(zhuǎn)移性患者部位的 TAM 數(shù)量，闡明巨噬細(xì)胞在 OS 中的作用。肺轉(zhuǎn)移中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物 Iba1 和 M2 巨噬細(xì)胞/促腫瘤標(biāo)志物 CD163 陽性細(xì)胞的數(shù)量和大小明顯高于原發(fā)腫瘤。這些細(xì)胞頻繁且高度共表達(dá)這兩種標(biāo)志物，表明 TAMs 可能支持 OS 進(jìn)展。

然后，將 OS細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)以模擬 TME（圖1 D）。WST、劃痕和侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，源自 OS 和 THP-1 來源的巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基（CM）促進(jìn)了 OS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（圖1 B-D），強(qiáng)調(diào)了 OS 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞因子對 OS 的促進(jìn)作用。

圖1 共培養(yǎng) CM 對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。
（A）將單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞并將其與 OS 細(xì)胞共培養(yǎng)。（B）使用 Cell Counting Kit-8 檢測對經(jīng)或不經(jīng)共培養(yǎng) CM 處理的 OS 細(xì)胞的細(xì)胞活力。（C、D）用或不用共培養(yǎng) CM 處理的 OS 細(xì)胞的劃痕和侵襲測定。

接下來，使用細(xì)胞因子陣列監(jiān)測細(xì)胞因子譜，研究了源自 OS 和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng) CM 促進(jìn)作用的確切機(jī)制，并觀察到了幾種細(xì)胞因子（包括 CXCL5 和 MCP-1）的改變。值得注意的是，共培養(yǎng) CM 中的 IL-8 水平顯著高于單獨(dú) OS 和巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的水平（圖2 A）。

進(jìn)一步研究人骨肉瘤細(xì)胞系 143B-Luc 或 SJSA-1 細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)中 IL-8 的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)當(dāng) OS 細(xì)胞與人或 THP-1 衍生的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，IL-8 的產(chǎn)生增加（圖2 B）。此外，將 OS-CM 添加到 THP-1 衍生的或人巨噬細(xì)胞中時(shí)增加了 IL-8 基因和蛋白質(zhì)表達(dá)（圖2 C）。值得注意的是，OS 細(xì)胞本身也產(chǎn)生 IL-8，并且當(dāng)巨噬細(xì)胞 CM 被引入 OS 細(xì)胞時(shí)，它同樣增加了 IL-8 基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，反映了巨噬細(xì)胞中添加 OS-CM 的效果（圖2 D）。此外，OS 患者的單細(xì)胞 RNA-seq 分析顯示，Iba1+ CD163+ TAMs 中的 IL-8 表達(dá)高于 Iba-1? CD163? TAMs（圖2 E-G）。這些結(jié)果表明，在 OS TME 中，TAMs 與 OS 相互作用以增強(qiáng) IL-8 的產(chǎn)生。

為了闡明共培養(yǎng) CM 中 IL-8 對 OS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，研究證實(shí)了 OS 細(xì)胞表達(dá) CXCR1 和 CXCR2，它們是 IL-8 受體。此外，重組 IL-8 在促進(jìn)兩種 OS 細(xì)胞類型的增殖、遷移和侵襲方面表現(xiàn)出相似的趨勢。使用抗-IL-8 抗體抑制共培養(yǎng) CM 中的 IL-8 減弱了共培養(yǎng) CM 促進(jìn)的增殖、遷移和侵襲。因此，共培養(yǎng) CM 中的 IL-8 在增強(qiáng) OS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮作用。

鑒于 IL-8-FAK（粘著斑激酶）通路在癌癥中的重要性，研究人員假設(shè)該通路可能對 OS 增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生類似的影響。同樣，在暴露于重組 IL-8 后，兩種 OS 細(xì)胞類型中觀察到 FAK 磷酸化。在共培養(yǎng) CM 中加入抗-IL-8 抗體可顯著抑制 FAK 磷酸化。此外，使用 FAK 磷酸化抑制劑也減弱了共培養(yǎng) CM 的促進(jìn)作用。這些研究結(jié)果表明，共培養(yǎng) CM 中的 IL-8 通過 FAK 通路增強(qiáng)了 OS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

圖2 骨肉瘤和巨噬細(xì)胞之間的相互作用增加了 IL-8 的產(chǎn)生。
（A）143B-Luc 細(xì)胞、人巨噬細(xì)胞和共培養(yǎng) CM 的細(xì)胞因子陣列。（B）OS 細(xì)胞（143B-Luc、SJSA-1）和巨噬細(xì)胞（THP-1 Mφ、HMDMs）共培養(yǎng)過程中 IL-8 的產(chǎn)生。（C）IL-8 在用 OS-CM 刺激的巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。（D）用巨噬細(xì)胞 CM 刺激的 OS 細(xì)胞中 IL-8 的表達(dá)。（E）OS 肺轉(zhuǎn)移的 UMAP 圖。（F）髓系細(xì)胞簇中 Iba1、CD163 和 IL-8 表達(dá)的 UMAP 圖。（G）Violin 圖描繪了 IL-8 在 Iba1+/- 或 CD163+/- 髓系細(xì)胞簇中的表達(dá)。

最后，通過裸鼠皮下移植OS細(xì)胞和每周3次向腫瘤旁注射共培養(yǎng)CM來研究IL-8在共培養(yǎng)CM中對原發(fā)部位的影響。在共培養(yǎng) CM 組中，143B-Luc 和 SJSA-1 細(xì)胞顯著增加了腫瘤體積和重量。IHC 分析顯示，共培養(yǎng) CM 組的 Ki-67 指數(shù)和磷酸化-FAK 水平高于對照組。

將抗-IL-8 抗體引入同一皮下異種移植腫瘤模型的共培養(yǎng) CM 中，與對照組相比，抗-IL-8 抗體組中 143B-Luc 和 SJSA-1 細(xì)胞的腫瘤體積和重量均受到抑制。值得注意的是，抗- IL-8 抗體不會誘導(dǎo)小鼠體重減輕，但 Ki-67 指數(shù)和磷酸化-FAK 水平降低。

肺轉(zhuǎn)移是影響骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，因此，通過用共培養(yǎng) CM 預(yù)處理 OS 細(xì)胞并將其靜脈注射到小鼠尾部，進(jìn)一步研究其對肺轉(zhuǎn)移的影響（圖3 A）。14 天后，共培養(yǎng) CM 組的 IVIS、肺集落計(jì)數(shù)和 Ki-67 指數(shù)均高于對照組（圖3 B-D）。通過在共培養(yǎng) CM 中加入抗-IL-8 抗體可減輕共培養(yǎng) CM 的轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用（圖3 E-H），表明共培養(yǎng) CM 中的 IL-8 可促進(jìn)體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移，從而突出了 IL-8 作為新治療靶點(diǎn)的潛力。

圖3 共培養(yǎng) CM 中 IL-8 對肺轉(zhuǎn)移的影響。
（A）OS 尾靜脈注射的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（B）注射經(jīng)或不經(jīng)共培養(yǎng)CM預(yù)處理的腫瘤后14天肺轉(zhuǎn)移的IVIS成像和定量。（C）肺切片的蘇木精和伊紅染色，有或沒有共培養(yǎng) CM 和肺集落的定量。（D）有或沒有共培養(yǎng) CM 的肺集落中 Ki-67 陽性細(xì)胞的免疫組織化學(xué)和 Ki-67 標(biāo)記指數(shù)的定量。（E）使用抗-IL-8 抗體進(jìn)行 OS 尾靜脈注射的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（F）注射經(jīng)共培養(yǎng)CM預(yù)處理的腫瘤后14天（含或不含IL-8抗體）肺轉(zhuǎn)移的IVIS成像和定量。（G）加或不加IL-8抗體的共培養(yǎng)CM肺切片蘇木精和伊紅染色及肺菌落定量。（H）聯(lián)合或不聯(lián)合IL-8抗體共培養(yǎng)CM肺集落Ki-67陽性細(xì)胞的免疫組化及Ki-67標(biāo)記指數(shù)的定量。

總之，該研究確定了 IL-8 是由 OS 和 TAMs 之間的相互作用產(chǎn)生的 TME 內(nèi)的細(xì)胞因子，并進(jìn)一步證實(shí)了它在體外、體內(nèi)和患者樣本中的重要性。研究結(jié)果還強(qiáng)調(diào)了 IL-8-FAK 軸是 IL-8 影響 OS 細(xì)胞的關(guān)鍵通路。考慮到腫瘤化療的發(fā)展，IL-8 成為一種有前途的新型治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Tatsuno R, Ichikawa J, Komohara Y, Pan C, Kawasaki T, Enomoto A, Aoki K, Hayakawa K, Iwata S, Jubashi T, Haro H. Pivotal role of IL-8 derived from the interaction between osteosarcoma and tumor-associated macrophages in osteosarcoma growth and metastasis via the FAK pathway. Cell Death Dis. 2024 Feb 1;15(2):108. doi: 10.1038/s41419-024-06487-y. Erratum in: Cell Death Dis. 2024 Jul 2;15(7):471. doi: 10.1038/s41419-024-06795-3. PMID: 38302407; PMCID: PMC10834992.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38302407/

Journal Impact Factor: 8.1

The ISSN (online) 2041-4889.

圖片來源： 所有圖片均來源于參考文獻(xiàn)

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