引言
GSPT1（G1 to S phase transition 1），作為人類基因組中的一個基因，編碼了一種重要的蛋白質，該蛋白質在細胞蛋白質合成的翻譯終止過程中扮演著關鍵角色。近年來，隨著生物技術和藥物研發的快速發展，GSPT1逐漸成為腫瘤治療領域的一個研究熱點。

GSPT1是一種翻譯終止因子，它通過結合eRF1（真核翻譯釋放因子1）來識別mRNA上的終止密碼子，從而促使翻譯完成的蛋白質從核糖體中分離出來。這一過程是細胞內蛋白質合成的重要環節，對維持細胞正常生理功能至關重要。

在腫瘤細胞中，GSPT1的表達水平往往發生異常變化。下調GSPT1可以導致多種腫瘤細胞中關鍵蛋白的異常表達，進而抑制腫瘤細胞的增殖或誘導其凋亡。這一特性使得GSPT1成為腫瘤治療的一個潛在靶點。

新型GSPT1降解劑的研發
為了更有效地利用GSPT1作為治療靶點，科學家們致力于開發能夠特異性降解GSPT1的小分子藥物。其中，PROTAC（Proteolysis-Targeting Chimeras）技術和MG（Molecular Glue）技術成為了研究的熱點。

PROTAC技術通過設計一種特殊的分子，使其能夠同時結合靶蛋白（如GSPT1）和E3泛素連接酶，從而促進靶蛋白的泛素化和蛋白酶體降解。而MG技術則利用小分子化合物觸發靶蛋白與E3泛素連接酶之間的緊密蛋白相互作用，實現靶蛋白的降解。

案例分享
研究者們基于先前的發現，即GSPT1的耗竭可以導致原代星形膠質細胞的細胞周期延遲，進一步研究GSPT1在膠質母細胞瘤治療中的潛在作用。

研究方法：
1.使用CC-885（一種能夠通過與CRBN結合促進GSPT1降解的藥物）處理攜帶U87膠質母細胞瘤細胞的裸鼠，觀察其生存期的變化。CC-885 治療延長移植 U87 細胞的裸鼠存活時間。將 1 × 106 個表達 iRFP720 的 U87 膠質母細胞瘤細胞移植到裸鼠的腦內。將 50 或 100 mg/kg 的 CC-885 溶解在 DMSO 中，并將等量的 DMSO（作為對照）在第 16、18、20 和 22 天（共 4 次）腹膜內注射給裸鼠。

移植、CC-885 給藥和使用體內成像系統 (IVIS) 評估腫瘤大小的圖表。B 在第 15 天和第 24 天使用 IVIS 評估腫瘤大小。C 繪制了從移植到死亡的存活期（x 軸）和存活率（y 軸）。n = 5。**P = 0.0021（DMSO vs. 50 mg/kg CC-885），**P = 0.0021（DMSO vs. 100 mg/kg CC-885），和**P = 0.0044（50 vs. 100 mg/kg CC-885），采用 Kaplan–Meier 方法和對數秩檢驗。D 在第 24 天使用 GSPT1 抗體通過免疫印跡 [n = 3（50 mg/kg CC-885）、2（100 mg/kg CC-885）和 4（DMSO）] 評估 CC885 對腦腫瘤中 GSPT1 表達水平的影響。通過使用 GAPDH抗體的免疫印跡確認蛋白質的比較負載。E 通過免疫染色評估 CC-885 對腦腫瘤的影響。移植的腦腫瘤（WT、經 CC-885 處理的 WT）在第 24 天被移除、固定并嵌入石蠟中。使用 GSPT1、Ki-67 和磷-ERK1/2 抗體對樣品進行蘇木精-伊紅 (HE) 染色和免疫染色（蘇木精復染）。n = 5；比例尺：100 μm（HE、GSPT1 和 pERK）和 50 μm（Ki-67）。使用 ImageJ 軟件測量腦腫瘤中的 F Ki67 免疫染色指數，并繪制 Ki67 指數。****P < 0.0001，通過單因素方差分析和 Tukey 事后檢驗。

2.制備GSPT1基因敲除（KO）的U87細胞和穩定過表達FLAG標記GSPT1的GSPT1-KO U87細胞（Rescued GSPT1-KO），并將其移植到裸鼠腦中，比較它們與野生型（WT）U87細胞的生存期。

移植 Rescued  GSPT1-KO  U87 細胞的裸鼠的延長存活期被取消。生成了穩定過表達  GSPT1-FLAG的GSPT1-KO  (A-7)  U87  膠質母細胞瘤細胞。A.通過使用 GSPT1 抗體的免疫印跡法證實Rescued  GSPT1 U87  細胞中  GSPT1-FLAG  的表達與 WT  U87  細胞中 GSPT1-FLAG  的表達相當。通過使用  β-actin  抗體的免疫印跡法證實了蛋白質的比較負載。B  評估并繪制了三種細胞系的生長率（WT和  Rescued  GSPT1-KO  中的 n = 10）。通過雙向方差分析和  Tukey  事后檢驗，WT  和  Rescued  GSPT1-KO  U87  細胞之間沒有顯著差異。GSPT1-KO(A-7)  細胞的生長曲線作為參考。  C  實驗圖表將  1  ×  106  GSPT1-KO  以及  Rescued  GSPT1-KO  U87  細胞移植到裸鼠腦內。D  移植有  GSPT1-KO  或  Rescued  GSPT1-KO  U87  細胞的腦腫瘤在第  20  天取出、固定、嵌入石蠟中，并對  GSPT1  進行免疫染色（n  =  5）。比例尺：100  μm。E  繪制了從移植到死亡的存活期（x  軸）和存活率（y  軸）。n  =  5；**P  =  0.0018，采用  Kaplan-Meier  方法和對數秩檢驗。

3.檢測GSPT1-KO U87細胞與WT U87細胞相比的凋亡情況，以及GSPT1-KO U87細胞移植的腦腫瘤與WT和拯救GSPT1-KO U87細胞移植的腦腫瘤相比的凋亡情況。

GSPT1-KO U87細胞對凋亡的敏感性。A、B、WT和GSPT1-KO U87膠質母細胞瘤細胞在62.5-500 nM濃度的斯塔烏羅辛（staurosporine）作用下9小時。為了評估細胞凋亡，WT和GSPT1-KO U87細胞裂解液通過抗PARP1抗體進行免疫印跡（A）。在每種斯塔烏羅辛濃度（250、375和500 nM）下，PARP1的裂解片段通過α-微管蛋白進行歸一化并繪制（B）。C-F、將WT U87細胞或經CC-885處理的WT U87細胞（C，第24天）以及WT、GSPT1-KO或恢復的GSPT1-KO U87細胞（E，第20天）移植到腦腫瘤中。將樣本從體內取出，固定并包埋在石蠟中。使用抗cleaved caspase-3抗體進行免疫染色。

4.患者腦膠質瘤樣本中GSPT1的表達情況，以及表達水平與患者預后的關系。

A-C 展示了3名患者腦膠質瘤樣本的GSPT1蛋白表達情況。上層圖為釓增強的MR圖像。中間和下層圖展示了GSPT1免疫染色與蘇木精復染的顯微照片。患者1為60歲男性，腫瘤位于右側額葉前部。患者2為64歲男性，腫瘤位于左側額葉。患者3為59歲男性，腫瘤位于右側頂葉。GSPT1在腦膠質瘤細胞的胞漿中表達。值得注意的是，GSPT1在血管細胞中不表達。患者1和2的GSPT1表達較強；然而，患者3的GSPT1表達較弱至中等。每個顯微照片底部左方的數字代表GSPT1 mRNA在實時RT-PCR分析中的相對表達值。GSPT1免疫染色水平與相對mRNA表達值之間無相關性。上層圖尺度條為100微米（上層圖）和50微米（下層圖）。D 比較了GSPT1免疫染色水平與GSPT1 mRNA相對表達值之間的關系。Kaplan-Meier曲線顯示根據膠質母細胞瘤樣本中GSPT1的mRNA表達水平將患者分為兩組。將87例膠質母細胞瘤患者按照GSPT1表達值的中位數進行分組。GSPT1high：GSPT1表達值高于中位數。GSPT1low：GSPT1表達值低于中位數。左側圖：神戶大學醫院的數據集。右側圖：TCGA膠質母細胞瘤2013（https：//www.cbioportal.org/）的數據集，可自由獲取。

結論

• CC-885處理的裸鼠相較于對照組有顯著更長的生存期，表明GSPT1的降解能夠抑制腦腫瘤的生長并延長生存期。
• GSPT1-KO U87細胞和Rescued GSPT1-KO U87細胞在裸鼠腦中的移植實驗顯示，GSPT1的缺失能夠延長生存期，而過表達GSPT1則沒有這種效果。
• GSPT1-KO U87細胞和GSPT1-KO U87細胞移植的腦腫瘤表現出增強的凋亡，說明GSPT1的缺失或降解使膠質母細胞瘤細胞更容易死亡。
• 盡管在膠質母細胞瘤患者樣本中檢測到GSPT1的表達，但GSPT1 mRNA水平與總體生存期之間沒有相關性，提示GSPT1對膠質母細胞瘤細胞的生長至關重要，但可能與其惡性特征無關。
• 研究者們提出GSPT1是一個潛在的膠質母細胞瘤治療靶點，但其作為翻譯終止因子的功能可能帶來意外的副作用，因此需要進一步研究以開發出最小化非靶向效應的新型藥物。

展望
基于GSPT1在腫瘤細胞中的重要作用以及近年來在藥物研發領域的快速進展，GSPT1在腫瘤治療中的應用前景十分廣闊。未來，隨著對GSPT1功能機制的深入研究以及新型靶向藥物的不斷涌現，GSPT1有望成為腫瘤治療領域的一個重要靶點，為癌癥患者帶來新的治療希望和選擇。

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驗證數據
GSPT1蛋白：高活性，高純度驗證

The GSPT1 activity was detected using HTRF technology. The reaction was performed by incubating the GSPT1 protein, CRBN and varying concentration of CC-885 and beads at 25℃ for 60 min,  then reading ratio 665/620 on BMG.

純度＞90%

GSPT1抗體:WB, IP, ICC等多重驗證

E3泛素連接酶:DDB1/CRBN Complex

The CRBN/DDB1 activity was detected using HTRF technology. The reaction was performed by incubating the varying concentration of lenalidomide, CRBN/DDB1 protein, substrate and beads at 25℃ for 60 min, then reading ratio 665/620 with BMG.

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參考文獻
1.Takashi Sasayama, et al. Potential of GSPT1 as a novel target for glioblastoma therap.Cell Death and Disease (2024) 15:572.
2.Alexander Hanzl?,et al.Functional E3 ligase hotspots and resistance mechanisms to small-molecule degraders.Nature Chemical Biology(2022).
3.Mary E. Matyskiela1, Gang Lu,et al.A novel cereblon modulator recruits GSPT1 to the CRL4CRBN ubiquitin ligase.NATURE(2016).
4.Z Yang, Y Sun,et al.Merging PROTAC and molecular glue for degrading BTK and GSPT1 proteins concurrently.Cell Research (2021) 0:1–4.

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